专利名称：预测中国人2型糖尿病易感性的试剂盒及引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预测2型糖尿病易感性的试剂盒及引物，更具体地，本发明涉及 利用新鉴别的2型糖尿病易感基因RORC(retinoid-related orphan receptor y)的6个 单核苷酸多态性(SNP)位点设计的预测2型糖尿病易感性的试剂盒和引物。本发明还涉及 R0RC基因在制备预测2型糖尿病易感性的诊断剂中的应用。
背景技术：
大量流行病学资料表明，糖尿病是一种具有明显遗传倾向的复杂的多基因遗传 病。遗传因素可明显影响机体对胰岛素的敏感性。目前对糖尿病易感基因的研究策略主要 包括定位克隆法、候选基因法以及二者相结合的定位候选克隆法近年来，大多数研究者致力于通过定位克隆法寻找糖尿病相关基因，即寻找患病 家系成员间共享的染色体DNA区域间的连锁。已发现2型糖尿病中的一些相对较少见的单 基因形式，称为青年晚发型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young，MODY)，是由 于突变导致了 3细胞功能低下。这些病人通常在青春期到成人早期发病，表现为葡萄糖反 应性胰岛素分泌缺陷。这些致病基因中有6个分别编码葡萄糖激酶、转录因子HNF1 a、1 3、 4a及胰岛素启动因子(IPF1)，神经细胞分化蛋白(NeuroDl)。这些基因的突变可最终导致 高血糖血症。这些单基因糖尿病的发病率还不确切，估计占所有2型糖尿病的5%。但是， 单纯利用定位克隆的策略来确定多基因遗传病的成功报道尚不多见。除定位克隆法外，目前对多基因遗传病的相关基因进行研究还有一种常用的方 法-候选基因法，即直接研究疾病候选基因的变异与疾病表型之间的关系。该方法主要基 于对家系或人群的病例_对照关联分析。关联分析不需要大的家系研究，而是比较某个或 某一套标记在患者和正常个体的分布程度。某种标记如果在患病个体中分布十分明显，那 么就可以认为该标记与疾病表型相关联。但是，候选基因法中由于对致病基因所在位置没有足够了解，在选择候选基因上 存在较大的盲目性，主要针对与疾病发生发展相关的一些代谢通路进行研究。将上述两种 方法相结合的定位候选克隆法在一定程度上弥补了任何单一一种方法的局限性，为目前多 基因遗传病研究中所普遍采用的策略。目前糖尿病候选基因的选择主要有两个来源，一是与疾病发生发展相关的一些代 谢通路，一是由定位克隆法所确定的染色体区域。2型糖尿病是一种多基因遗传病，其易感 性是多个基因相互作用的结果，因而本发明人以一种新的思路来选择候选基因，即以本组 以往研究所获得的中国汉族人群2型糖尿病易感基因为靶基因，在其共表达基因和所处的 代谢通路中寻找候选基因，以期构建2型糖尿病易感基因网络图。同遗传病研究策略相对应，其研究工具一多态性标记也从第一代的限制性片 段长度多态性(Restrictive Fragment Length Polymorphism，RFLP)，第二代的微卫星 标记(Microsatellite Marker)发展到第三代的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 尤其在对多基因遗传病进行病例-对照关联分析中，需要利用大量高密度的标记物，前两代多态性标记已不能满足这 种要求。因此，近年来，SNP作为第三代遗 传图谱的构建者已越来越引起人们的广泛关注。单核苷酸多态性(SNP)主要是指基因组水平上由单核苷酸的变异所引起的DNA序 列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。SNP 在人类基因组中广泛分布，平均每500-1000个碱基中就有1个，其总数估计可达300万个 甚至更多。近年来，随着人类基因组及遗传学研究的进展，SNP在全面深入地了解个体和群 体间基因组的变异或多态性及疾病研究等方面也越来越显示出其重要意义。将SNP用于疾 病易感基因定位的一个最大的优点就是它的分布广泛性。其次是它有比微卫星更高的稳定 性，可以最大限度地减少遗传过程中由于序列变异所导致的信息遗失。另外，SNP很容易实 现高通量的分型，短时间内可以产生大量的结果，这一点是微卫星所无法比拟的。SNP的上 述特点决定了它非常适合于进行像糖尿病这样的多基因疾病，尤其是多个微效基因所导致 的疾病的定位研究。选择合适的病例和正常对照，采取关联分析的研究方法，对SNP而言， 是非常适合的。本发明人近几年来一直从事中国北方汉族人群2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿 病，NIDDM)易感基因定位研究。在先前本组进行的候选定位克隆研究中，发现了 6个中国汉 族人2型糖尿病易感基因(PRKCZ，UTS2，CASP9，CDC212，P⑶，SAC)，本发明人以一种新的思 路，尝试从上述基因所处通路中的功能相关基因及共表达基因中选择合适的候选基因，利 用SNP进行病例-对照关联分析，最终鉴定了一个中国汉族人群2型糖尿病易感基因(即 RORC基因)，以及该基因上的6个与中国汉族人2型糖尿病特别相关的SNP位点。由此经 过深入研究完成了本发明。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种预测2型糖尿病易感性的试剂盒，所述试剂 盒包含基于图1-6的序列设计的用于PCR扩增的特异引物以及通过核酸扩增进行检测的试 剂盒所含的常规组件。所述引物针对图中所示的SNP位点而设计，长度为18-25bp左右。根据本发明的另一方面，提供了 RORC作为糖尿病易感基因在制备用于糖尿病诊 断的试剂中的应用。
图1-6示出本发明的SNP位点(R1-6)所在的RORC基因区域的核苷酸序列。定义单核苷酸多态性(SNP)主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。基因分型及等位基因频率分布同一种群生物中，相同等位基因核苷酸序列顺序 分析，在此表示相同SNP位点在不同个体中的组成成分的确定，为基因分型。等位基因频率 是指所研究的同一种类等位基因里，所期望出现的等位基因占的比例，也就是出现变化的 等位基因的所占比例。疾病易感性(糖尿病易感性)人群对疾病容易感受的程度。病例-对照关联分析是一种由因及果的回顾性研究。它是先按疾病状态确定调查对象，分为病例和对照组，通过比较病例组与对照组间所研究的遗传标志出现频率的差 异而获得该标志与疾病间关联的信息。参数连锁分析和非参数连锁分析根据基因的重组率来计算两个基因之间的染色 体图距即连锁分析，用分类变量(离散变量)来进行分析，把测量指标按某一标准归类，计 数，然后进行分析为参数分析，用实际测量后的结果进行的分析为非参数连锁分析。本专利涉及的 RORC(retinoid-related orphan receptor γ )基因，全长约 25kb， 定位于Iq21_q23，属于核激素超家族成员，这个家族是结构上相关的配体依赖性转录因子， 包括PPARy、RXRY以及大量的孤核受体，这些因子是生物体生理调解过程中的关键调节 因子，在脂类和葡萄糖代谢平衡中发挥重要作用，许多因素证明该基因为2型糖尿病易感 的候选基因，能够与PPAR Y形成异二聚体，另外RORC在骨骼肌细胞高量表达，在脂肪细胞 分化中诱导表达，而且其在淋巴和胸腺的器官形成中发挥关键作用，在胰腺和棕色脂肪组 织中也有表达，除淋巴组织外，其在其他组织中 有类似的作用。基于这些考虑和该基因定位 于重复连锁区域，我们采用连锁分析、分子扫描对该基因的进行了相关性的评估。
具体实施例方式目前有多个公共数据库储存了几百万条SNP信息，人们可以通过多种方式进行查 寻，如以基因名、登记号、染色体号、功能级别等。但是，这些数据库中的SNP绝大多数只是 “候选者”，而非经过验证的真正SNP。它们是利用计算机在对多个克隆序列进行比对时发掘 出来的，其中必然存在一部分假阳性SNP。另外，这些SNP大多数是利用高加索人和黑人测 序寻找的SNP，在中国人群中的分布有些不一定相同，我们利用中国汉族人群的糖尿病患者 和正常对照，重新测序寻找SNP。并利用我们在中国汉族糖尿病人群中发现的高频的SNP进 行基因分型。为寻找2型糖尿病易感基因，本发明人根据美国国家生物信息学(National Center for Biotechnology Information)中心公布的信息，尝试从本组先前发现的6个中 国汉族人2型糖尿病易感基因(PRKCZ，UTS2，CASP9，CDC212，P⑶，SAC)所处通路中的功能 相关基因及共表达基因中选择了 RORC基因，对该基因的5’侧翼序列lkb、外显子、临近的内 含子区域以及3’非翻译区进行测序筛查中国北方汉族人群中的SNP，并对其中部分高频的 SNP进行基因分型，通过序列测定的方法对其在病例组及对照组进行分型并进行病例_对 照关联分析。如以下实施例所详细讨论的，RORC基因内所选择的13个高频(等位基因频率 > 15% )的SNP位点中进行基因分型，发现6个SNP位点和糖尿病相关，等位基因频率分布 在病例组和对照组中的差异有统计学意义(P < 0. 05)，提示这些SNP位点与2型糖尿病相 关，进一步得出结论，RORC基因为中国汉族人2型糖尿病的易感基因。因此，本发明的一个方面涉及糖尿病易感基因RORC基因在预测糖尿病易感性中 的应用。基于RORC基因，可以获得各种诊断试剂和试剂盒以用于预测糖尿病易感性。本发明还涉及用于预测糖尿病易感性的引物。所述引物基于RORC基因的核酸序 列而设计，由此，PCR扩增后的产物测序可以直接测得SNP位点。当然，本发明的引物也可以 基于图1-6的互补序列设计，这样PCR扩增后的产物测序得到SNP的互补碱基。下表1举 例示出了本发明的引物序列，引物的解链温度(Tm)以及扩增得到的产物大小。
表1用于扩增的引物序列 本发明进一步涉及包含本发明的一或多种引物的试剂盒，该试剂盒用于检测糖尿 病的易感性。除了本发明的引物之外，所述试剂盒还包含运用PCR扩增而进行检测的试剂 盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟悉这些常规组件和检测方法。以下将参照实施例进一步描述本发明。实施例1、中国汉族人群2型糖尿病易感基因RORC基因的鉴定及该基因内SNP的 相关研究1、中国汉族人群2型糖尿病患者及正常对照标本的收集本发明所用2型糖尿病组和正常组人群外周血样(IOml)主要来自北京协和医院 内分泌科门诊。糖尿病病例可为散发，也可为糖尿病家系的成员(但此时每一家系中通常 只有一个患者入选，同一家系中没有任何血缘关系的成员可以选择一个以上)；正常对照 来自正常人群，要求其家庭三代以内没有糖尿病患者(包括I型糖尿病)，对照组与患病组 年龄及性别相匹配。2型糖尿病的诊断严格按照WHO于1985年颁发的标准执行。即空腹血葡萄糖浓 度≥7. 8mmol/L或餐后2小时血糖≥11. lmmol/L为糖尿病。OGTT的判断标准为服糖后2小时血葡萄糖浓度< 7. 8mmol/L为正常，彡11. lmmol/L为糖尿病，在7. 8-11. lmmol/L之 间为糖而才量低减(impaired glucose tolerance, IGT)。入选的每个成员记录一般情况，包括性别、出生年月、籍贯、身高、体重、心率、呼 吸、血压等项目，调查并在必要时进行特殊检查，以排除合并有高血压、心脏病、动脉粥样硬 化等疾病。除上述项目外，对糖尿病患者还记录发病年龄、既往最高体重、血脂、糖化血红蛋 白及糖尿病并发症等项目，对正常对照组还测量空腹血糖并排除有糖尿病家族史者。
采集血样前确保所有成员都了解采血目的，即有知情权，并在“知情同意书”上签 字。将收集的资料严格保密，不对外公布供血成员的姓名、年龄、疾病等所有资料。共采集到714份标本，其中病例组371份，对照组343份。两组在性别、年龄上相 匹配，糖尿病患者的平均年龄为53. 01岁，正常对照采样时的平均年龄为49. 68岁。在所有 成员中，男女的比例为361 353，病例组男性190人，女性181人；对照组男性168人，女 性175人。两组成员的年龄分布情况如表2 表2患病组和对照组成员的年龄构成 2、候选基因的确定及候选基因中用于基因分型的SNP位点的选择基于本组先前 发现的6个中国汉族人2型糖尿病易感基因(PRKCZ，UTS2，CASP9，CDC212，P⑶，SAC)，本发 明人根据美国国家生物信息学中心(National Center for Biotechnology Information) 公布的信息，在此6个基于所涉及通路中的功能相关基因及共表达基因中选择了 RORC为中 国汉族人群2型糖尿病候选基因，对该基因的5’侧翼序列lkb、外显子、临近的内含子的区 域以及3’非翻译区进行测序筛查中国北方汉族人群中的SNP，并对其中13个高频(等位基 因频率彡15% )的SNP进行基因分型及关联性分析。3、SNP位点基因分型分析利用primer5. 0软件进行引物设计，针对RORC基因中的13个SNP位点中的每一 个SNP位点设计2条引物，分别为正向、反向引物、。引物设计原则引物长度在18-25baSe左右，Tm值在57 62°C之间。PCR产物长 度适中，符合耐热酶扩增范围。反应条件及产物鉴定针对RORC基因中的13个高频SNP位点进行PCR，反应体系 15 μ 1，各组分如表3 表3ARMS PCR反应体系 注所使用的 Q-solution、buffer> Mgcl2、HotstarTaq 均由 QIAGEN 公司的 HotstarTaq试剂盒提供采用常规PCR，其程序如下94°C、5分钟后，94°C 30秒、退火60秒、72°C 50秒，进 行30个循环，最后72°C 10分钟1次，反应结束后送测序。基因型判定及数据整理根据测序结果判定SNP基因型。将各位点分型结果整理 为Excel格式以进行统计处理。以上各SNP位点的分型均先在96个随机选取的正常对照 个体中进行。在病例组和对照组中，上述13个分型的SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡，经 SPSS 统计软件 11. 0 版(免费下载于 http://linkage, rockefeller, edu/soft/)分析，有 6 个SNP位点等位基因频率分布在两组中差异有统计学意义(P < 0. 05)，如表4所示，且基因 单倍型分布在两组中的差异也具有统计学意义(P < 0. 05)，如表5所示，进而提示RORC为 一种新的糖尿病易感基因。表4R0RC基因SNP位点基因频率的分布 RORC所在基因组序列全长约25kb，本发明所揭示的SNP位点(R)位于该序列的5， 侧翼序列区、1、2、8、10内含子，这一区域的核苷酸序列如附图1-6所示，图中R1-6为SNP位 点，如Rl其代表碱基T/C为多态性，即该位点可以为T，也可以为C。基于这些SNP位点，可以设计合适长度的引物，用于经PCR扩增而预测糖尿病易感性。实施例2预测糖尿病易感性引物的设计及糖尿病易感性的预测根据SNP位点所在的序列(图1-6)，设计如表6中SEQ ID NO :1，3，4，9，11，12所 示的引物，以得自待测个体血样的基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行测序检 测所述SNP位点的单核苷酸多态性。表6SEQ ID NO 1，3，4，9，11，12 所示的引物
GCTTGCCCTC TCCATGCCAG GTGCCACGTG CACCAGGTGG GGGGGAGTGG GCGAGTCACG AGGCTGTGGC ATGGCTGACT CCTGCTCTGC TGTTTACCAG CTGGGAACGA GAGCAGGAGG AGGTGCCAGG GAGCCTCTTG CTGCAGCCTG GCCCCTGGCC AGTTGCTTGT TGGGTAACCA GGAGAGTCAG GCCCAGCTAA TCAAACTCTG GGCCCAGGCC ATGCAGGAGA AAAGCAGCAC
Rl
CAGGATCCCC AGAAGCCTCG TCCTCTTGGC CCCCTTCAGA GCCTTCACTG CAGGCCTCAG TGTGGGCCAC TAGGTCTGGG AGCCTCTCCT TCTCCCAATG AGTCCAGTGC AGCATCTCTC CTCTCCTCTT CCCCACCATG GCTTCTCTGC CTCCAGGCAC TCCTCCAGGC CTGCCCCTTG CCCCAACAGA TGAGGAGCAC GTAGAAGCAT CAGGGGGTCA GGGAGTCCTG GCAAGAGCAG CAAGGGTTAG GGGCAGGGGC CGAGCAGGCA GAGGCCTCAG GGAACTGAAC AGTCACTGGG AGGAGTCTGA CTGCATCCTA GAGAAGAGAC ACAGTCCCCC AAACCTGCCC TCTCCATCTC CCCTATGCCT GTCACCTGTC TTAGGTAGAA ATCACAGGAT TCTAAAGTCA CAAAGACTTG GGTCCAAATC ATAGCTCACC CATTTATTGT TCTTGTGTGA GTCCTTGGGC AAAATCATTA ATATCTCTGA GAATCCCTCC ACTCACTGAT CAATCTGGAA TAATAATGTT TCCCTGTGGT GGGTGCTGTG AATATTTACA CAAAGTAAAA GCATGGATTT ACATAAAGTG TCCTGCAAAG GGCCCAGCAC ACAGTAAGTG ΑΤΤΑΑΤΑΑ Τ GCTAGTTCCC TTCCTTTCTC CTGTCCTGTT TCTCCTCAAG GCTCCATGCA CTGGTCCACT GGTCTCTCCT CATGTCCCCT CCTGGTGCCA GGACACTCTG CCAGCCACTC CTTTTCCCTG CCTGCTGGAG G图 1
CCTGCCTGCC CTTCAGACGC CAGGCTCTGA GGGAAGGAGT GCGGCAGTGG GATCCTAGGA
R2
GTGGGGAAAG TGTCTCAGCC CCTCATGATC TTCAACCTTT GACGTCAACC CCCTCTCTTG TCTTTACAGA GCTGCTGGCT GCAAAGAAGA CCCACACCTG TGAGTAGGGG GTCCGGGGCA AGAAAATGGC TGGGGCATAA TGAGATGGAG AATAATTCAG CAAGTGATCT GTGGGGGGAC TGAGGTTGGA CAGAGGTGGA GGAGTCAGGA AGAGATGGCA GGCAACAGGA AAGCAAGGGG AGGTGCGAGG AAACCACAGA TCAGGGCAGT GGGAGGAGAT GAGGAAGAAG CCTGAAGCA图 2
CTTGACACTG TTAGGATGTG GTGGCATGGA TGATGCCAAC
CATTTGGCAT TTCACTTCCC TGGAGAAGTA GTGGAAGCAC
TGCAGAAAAG CCTCCTGGGC GATCCCTTGC AAAATCTGTG TGAGGGGTGC AAGGTGAGTC AAGCGCGCGC GCGCGCACAC GGTTAATGGC CTTTGTTCTG
图3
CCTGGCTTTG GTGGTGCTGG GGCAAATACG GGGAAGATTC R4
GGCGAATTGC
图4
ATCCAGCACA TCTTGTTCTC GAAAGTAGAA TCATCGCCAA CATCGCTAGC
GAGTGCGGGA GAACAGCTAC
图5
CTCTCACTTC TGCCAAAGTG
CTTCCATTTT CAGGTACCTG
TGACCTACTT GGGACAAGTC ATAGGCATGT ACACACACAC ACTCCAGGGA
GCAAGAGGGA TATCTGCAGC R3
CTCTTTCTCT GTCTGGGATC GTATGCATGC ACACAGTGTC TGATC
AACAGCAAGC TGGAGCTGGT CCAGGTACAT GGTGGTTGAA
CTTCCAGCAC AAATTGAAGT CACTACGGGG TTATCACCTG ATGTGTGCGT GTGCATACAC TCCTTAGAGA TAAACAAGGG
TCCCTGCATC CCGGGCCTAC GCTGTTCCGA CCCAGGCAAA
TTCTCTCCCC AATGCTGACA GCCTTGGGTG GCTTTGTGAC
ACTGCCCAGG ACCGCACGGT AGGGGCAGGG CCAGGGCACC
AGCAATGGAA CTTTTTTGAA AGAAATGAGA CTCTTTTCAG
CCCCTCTGCT CTAAACACAA TAAGGGCGGT GTCCT
GATGTCCACA ATTACGGTCC CAGCTGCAGT AGCATCCTGG TCTGTAACAT
GTACCACTCT TTCCACGTGC
AAGATACACC CACCCCCTCC ACAATCTGGA CAAAGGTAGG CAGAGTTTGC R5
CTGTTAGAGA ATAAAGACTG
CTTTTGTTGG TCCAGATCGG GCTGGCCTTT AGCAGTCCCT GAGGGCCGGG
GCTTGCATCA GAAAGTTAGA
GAGTTAATGT CCAGGGCTCC CATCATCATC GGGGTAGAAG GTCTGTGGGT
CCATGTTCTT AAGAGAAAAG TCTGCAAGAC AGGCCAGGCC ACAGAGGAGG
GCAGTGGGAA CTAAGGGAAT GGGCCTG
TGAGCGGACT CATATCCAGC CTGCAGATCT AAGGAGCTCT GGGACTCCTT CACCCTTTTC CAGATGCTGC
图 6
CCTCCAGTGT CCAAGTACAT
TCTTTGCTCT TGCCACCCAA TCCAGCACCT TCAGCACTGA GCCTCTCCCT CTTTCCCATG G
CCTGAACACA CACGTACTTC TACCAGTGGG ATTTGGCTGG AAGGGGAAGG CAAGGAGGGT TTGTCCTAGC CCAGGAAGAA
R6
GAGGAGAGCT GGGGAAGCTT CCACCCCATC AACCGAGTCA ATGGCCTGCT AACCCTGGAG
GAAGTATTGA CGGAGCCTGT GTGGTCCAAG CCTGTGGGGC GGCCCACCTC GGTGGTCCCC
CCCTCCCTTC GTAGCCAGCA CCGCTTTCCC TGTCCAAGTG CCTGGACCCC ACCAGCTCTT
CCCATTAACC TGTGGAAAGG TCCACTCTAC ACCTGGAAGA GTTCCACCCT TGGAAGTGAG
权利要求
用于预测2型糖尿病易感性的基因引物，所述引物为基于图1-6的序列而设计的用于PCR扩增的特异引物，所述引物针对表中所示的SNP位点R1-6而设计，长度为18-25个核苷酸。
2.如权利要求1所述的引物，其包含选自SEQID NO: 1-12组成中的任一序列。
3.预测2型糖尿病易感性的试剂盒，其包含如权利要求1-2任一项所述的引物。
4.R0RC基因在制备用于预测2型糖尿病易感性的诊断剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及用于预测2型糖尿病易感性的试剂盒及引物，更具体地，本发明涉及利用新鉴别的2型糖尿病易感基因RORC的6个单核苷酸多态性(SNP)位点设计的预测2型糖尿病易感性的试剂盒和引物。本发明还涉及RORC基因在制备预测2型糖尿病易感性的诊断剂中的应用。
文档编号C12Q1/68GK101871003SQ20091008226
公开日2010年10月27日 申请日期2009年4月22日 优先权日2009年4月22日
发明者左瑾, 常永生, 方福德 申请人:中国医学科学院基础医学研究所