专利名称：一种链格孢db2菌株及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于链格孢菌株及其制备和应用领域，特别涉及一种链格孢DB2菌株及其制备应用。
背景技术：
麻是纺织原料之一，其品种主要有亚麻、苎麻、大麻、黄麻、红麻、罗布麻、剑麻、蕉麻、荨麻和苘麻等。麻纤维是从各种麻植物取得的纤维的统称，具有吸湿、透气、散热和抗菌等其他天然纤维无法比拟的优点。我国作为世界上麻类资源最丰富的国家之一，每年生产的麻纤维及其制品除满足国内市场的需求，还作为大宗商品出口美国、西欧及东南亚国家， 年均创汇近百亿美元。在国家节能减排政策和消费者回归自然、追求绿色的消费观念推动下，麻类纤维绿色加工技术已经成为纺织领域的研究热点。亚麻、大麻、黄麻和红麻纤维的主要组成为纤维素，此外还有较多的半纤维素、果胶和木质素等非纤维素物质包裹在麻纤维表面。这些胶质，特别是木质素等非纤维素物质胶结在纤维外面，使得原麻呈坚固的片条状。所以，原麻在纺纱过程中须通过一道脱胶过程去除木质素等胶质，以满足纺纱要求。目前，麻纺行业常用的煮练方法主要是化学方法，即利用强酸强碱对原麻或麻粗纱进行处理。化学处理工艺能耗大，设备损耗大、且排放的废水无法循环利用，污染问题严重。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种链格孢(Alternaria alternate)DB2菌株及其制备和应用，该菌株具有对亚麻、大麻、黄麻或红麻等韧皮纤维木质素降解的能力，其制备方法工艺简单，适合大规模工业化生产。本发明的一种链格孢菌(Alternaria alternata)DB2菌株，其18S rRNA基因序列，如下CTGGACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCT TGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATT ACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGA GCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAG TAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCAT TAAGCCTTTTTTTTCAACTTT TGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCA。上述链格孢菌(Alternaria alternata)DB2菌株，特征如下菌落绒毛状，灰绿色，边缘白色，背面褐色；菌丝白色，等径生长，比较致密；菌落较平整，边缘很整齐；(PDA培养基，28°C培养5d)菌丝形态菌丝有隔，浅色，分枝产孢方式及孢子形态分生孢子梗多分枝；分生孢子浅褐色，比菌丝颜色深；三角锥形，比较饱满；多细胞，有横隔和纵隔，隔很明
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本发明的链格孢菌(Alternaria alternata) DB2菌株的保藏号为CGMCC No. 4695， 保藏日为2011年3月17日，建议分类命名为(Alternaria alternata)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。根据18sR DNA测序(如图5、图6)Blast及聚类分析结果，该菌与链格孢相似性为 99%，结合生理生化试验结果和镜检分析，命名此菌株为链格孢(Alternaria alternata) DB2菌株。本发明的一种链格孢DB2菌株的制备方法，包括(1)将腐烂海草按Ig 20ml的比例置于富集培养基中室温静置培养30天，然后取0. Iml富集培养基涂布于分离培养基中，30°C静置培养1 4天，获得野生型亚麻生物处理优势菌株；(2)将步骤(1)中得到的菌株接种到亚麻木质素营养培养基中，28°C培养72h ；(3)从上述亚麻木质素营养培养基中选择出具有降解木质素能力的菌株，即得。所述步骤(1)中的富集培养基配方为亚麻粉5g，自来水200ml，pH自然；分离培养基配方为亚麻粉 5g, (NH4) 2S045g，K2HPO4 lg，MgSO4O. 5g，KCl 0. 5g, FeSO4O. 01，琼脂 20g， 水 IOOOmL,用 NaOH 将 pH 调节到 7-7. 2。所述步骤(2)中的亚麻木质素营养培养基的组分包括亚麻木质素2g，NaN0s3g, K2HPO4O. 5g，MgSO4 lg,琼脂 20g，水 lOOOmL，用 NaOH 将 pH 调节到 7-7. 2。本发明的一种链格孢DB2菌株在过氧化物脱胶制备纺织用亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维工艺中的应用。上述的应用步骤，包括(1)将链格孢DB2菌株保存于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，30°C 220rpm培养48h， 添加冻存缓冲液；冻存缓冲液由磷酸二氢钾0. 0627g,磷酸氢二钾0. 0177g,柠檬酸钠 0. 0588g，七水合硫酸镁0. 02645g，甘油10ml，加水定容至100ml制得；(2)在灭菌冷却后的50mL马铃薯葡萄糖培养基中，接入步骤(1)所得的菌一环，在转速220r/min、温度30°C条件下摇瓶培养48h ；(3)将步骤(2)所得的培养基接种入亚麻木质素发酵培养基5L，在转速220r/min、 温度30°C条件下摇瓶培养48h得到发酵菌液；其中，亚麻发酵培养基配方为亚麻原麻木质素 5g，KCl 0. 05g，磷酸氢二钾 0. lg，MgSO4O. 05g，FeSO4O. OOlg, (NH4)2SO4O. 5g，补水至 100ml
定容；(4)将灭菌后的亚麻、大麻、黄麻或红麻原料与步骤(3)所得发酵菌液按浴比 1 20混合，在30°C下160-220rpm摇床中分别处理1 4天，处理时间到时，除去发酵液， 停止生物处理；得到亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维；(5)将上述亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维和脱胶液混合，在30-10(TC温度下处理 1-5小时，然后水洗，按常规的方法上油，干燥，即得到可供纺织用的纤维；其中亚麻、大麻和黄红麻纤维对脱胶液的重量比为1 10-1 20，脱胶温度为30-100°C，时间为1-5小时。步骤(4)中所述的亚麻、大麻、黄麻或红麻原料为麻的原茎、纱线或织物。步骤(5)中所述的脱胶液是由过氧化物脱胶剂、螯合剂、氢键破坏剂和水组成；其中过氧化物脱胶剂、螯合剂和氢键破坏剂之和与脱胶溶液的重量比1:8-1: 25。
步骤(5)中所述的过氧化物脱胶剂为过氧化氢、过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铵、 过碳酸钾、过碳酸钠、过碳酸铵、过硼酸钾、过硼酸钠或过硼酸铵，其用量为亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维重量的0. 25-8%。步骤(5)中所述的螯合剂是磷酸钠、三聚磷酸钠，偏磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠的一种或几种，其用量为亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维重量的0. 1-4% ；氢键破坏剂是尿素，其用量为亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维重量的0. 05-2%。本发明提取菌株的DNA进行PCR扩增，选用真菌18S rRNA基因通用引物序列 (5-ATTGGA GGG CAA GTC TGG TG-3 和 5-CCG ATC CCT AGT CGG CAT AG-3)；进而测得菌株 18S rRNA全序列，如下CTGGACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTT GGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTAC AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAG AATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCA TTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGC AGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTT TTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCA。在构建的培养条件下，该菌株培养条件粗放，耐热性好，生长繁殖快，可以有效去除亚麻、大麻和黄红麻纤维中的木质素等胶质，且酶活稳定，菌、酶均无毒性。该菌株及培养系统能够直接用于亚麻脱胶。菌种前处理或处理后，实用环境友好型过氧化物进行灭活处理，以替代传统的沸水灭活工艺，以节约用水；同时利用灭活工艺中过氧化物的强氧化性对菌种处理后的麻试样进行精炼和漂白处理，以进一步优化工艺，节能减排。本发明的菌株具有对亚麻、大麻和黄红麻等韧皮纤维木质素降解的能力，能应用于韧皮纤维表面改性。本发明提供菌株及培养系统能够直接用于亚麻、大麻和黄红麻等韧皮纤维纺织加工的生物前处理。本发明提供菌株具有生长周期短，菌种不易被污染，处理成本低，处理后纤维质量好，脱胶条件温和，抗污染能力强，耐热性能好，无环境污染等优点； 与现有技术相比，本发明具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点，对于探索产紫青霉菌在大规模生产条件下进行韧皮纤维表面改性和纺织加工前木质素去除的生物前处理具有重要意义。有益效果(1)本发明提供菌株及培养系统，经检测可同时高产果胶酶和半纤维素酶，能够直接用于亚麻脱胶，具有脱胶周期短，纤维分散率达100 %，对亚麻脱胶效果良好，脱胶效率达 95%,菌种不易被污染，处理成本低，纤维质量好，脱胶条件温和，抗污染能力强，耐热性能好，无环境污染等优点；(2)本发明具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点。利用该体系进行亚麻脱胶具有脱胶时间短，亚麻纤维分散率达到100%，脱胶率达到90%以上，精干麻质量好。
图1为显微镜染色照片(油镜)；
图2为土豆马铃薯培养基菌落照片；图3为真菌处理过程照片；图4为处理后亚麻纤维照片；图5和图6为链格孢DB2菌株的18SrDNA序列。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1亚麻脱胶菌种的筛选获得(1)从东海舟山海域取样腐烂海草，先将海草与富集培养基按Ig 20ml的比例于富集培养基中室温静置培养30天，然后取0. Iml富集培养基涂布于分离培养基，30°C静置培养1 4天，获得野生型亚麻生物处理优势菌株；其中，富集培养基配方为亚麻粉5g，自来水200ml，pH自然；分离培养基配方为 亚麻粉 5g, (NH4) 2S045g，K2HPO4 lg，MgSO4O. 5g，KCl 0. 5g，FeSO4O. 01，琼脂 20g，水 lOOOmL， 用NaOH将pH调节到7-7. 2 ；(2)将步骤(1)中得到的菌株接种到亚麻木质素营养培养基中，28°C培养72h。 亚麻木质素营养培养基，其组分包括亚麻木质素2g，NaN0s3g, K2HPO4O. 5g，MgSO4 lg，琼脂 20g,水 IOOOmL,用 NaOH 将 pH 调节到 7-7. 2 ；(3)从上述培养基中选择出具有降解木质素能力的菌株。实施例2发酵菌液的制备(1)链格孢DB2菌株保存于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，300C 220rpm培养48h，添加冻存缓冲液；冻存缓冲液由磷酸二氢钾0. 0627g，磷酸氢二钾0. 0177g，柠檬酸钠0. 0588g, 七水合硫酸镁0. 02645g，甘油10ml，加水定容至100ml制得；(2)在灭菌冷却后的50mL马铃薯葡萄糖培养基中，接入步骤(1)所得的菌一环，在转速220r/min、温度30°C条件下摇瓶培养48h ；(3)将步骤(2)所得的培养基接种入亚麻木质素发酵培养基5L，在转速220r/min、 温度30°C条件下摇瓶培养48h得到发酵菌液；其中，亚麻发酵培养基配方为亚麻原麻木质素 5g，KCl 0. 05g，磷酸氢二钾 0. lg，MgSO4O. 05g，FeSO4O. OOlg, (NH4)2SO4O. 5g，补水至 100ml定容。实施例3亚麻脱胶工艺如下将5g亚麻原茎置入250ml三角瓶，以亚麻原茎与实施例2的发酵菌液按浴比 1 20分装于三角瓶中，装液量为100ml，在40°C，200rpm摇床中分别脱胶1天；脱胶时间到时，除去脱胶液，停止生物处理。将生物处理后的亚麻原茎进行灭活处理，其工艺为生物处理后的亚麻原茎和脱胶液以1 10的比例混合，并在70°C的条件下处理3小时，其中过氧化物的用量为亚麻原茎的3%，尿素用量为亚麻原茎的0. 05%，三聚磷酸钠的用量为亚麻原茎的2%，乙二胺四乙酸二钠的用量为亚麻原茎的0. 1%。脱胶后可制的2130支的纺织用亚麻纤维。实施例4大麻织物生物处理工艺如下将5g灭菌后的大麻织物置入250ml三角瓶，以大麻织物与实施例2的发酵菌液按浴比1 20分装于三角瓶中，装液量为100ml，在35°C，200rpm摇床中分别脱胶2天；脱胶时间到时，除去脱胶液，停止生物处理。将生物处理后的大麻织物进行灭活处理，其工艺为 生物处理后的大麻织物和脱胶液以1 25的比例混合，并在90°C的条件下处理1小时，其中过氧化物的用量为大麻织物重量的5%，尿素用量为大麻织物重量的1%，磷酸氢二钠的用量为大麻织物重量的2%，磷酸二氢钠的用量为大麻织物重量的2%。脱胶后制备的纺织用大麻织物手感柔软、白度高、刺痒感显著降低。实施例5黄麻纱线煮练工艺如下将5g灭菌后的黄麻纱线置入250ml三角瓶，以黄麻纱线与实施例2的发酵菌液按浴比1 20分装于三角瓶中，装液量为100ml，在40°C，200rpm摇床中分别脱胶4天；脱胶时间到时，除去脱胶液，停止生物处理。将生物处理后的黄麻纱线进行灭活处理，其工艺为 生物处理后的黄麻纱线和脱胶液以1 8的比例混合，并在100°C的条件下处理8小时，其中过氧化物的用量为黄麻纱线重量的8%，尿素用量为黄麻纱线重量的2%，偏磷酸钠的用量为黄麻纱线重量的2%，乙二胺四乙酸二钠的用量为黄麻纱线重量的2%，三聚磷酸钠的用量为黄麻纱线重量的2%。脱胶后可制的760支的纺织用黄麻纱线。实施例6亚麻纱线煮练工艺如下将5g灭菌后的亚麻纱线(亚麻粗纱或亚麻二粗)置入250ml三角瓶，以亚麻纱线与实施例2的发酵菌液液按浴比1 20分装于三角瓶中，装液量为100ml，在40°C，200rpm 摇床中分别脱胶1天；脱胶时间到时，除去脱胶液，停止生物处理。将生物处理后的亚麻纱线进行灭活处理，其工艺为生物处理后的亚麻纱线和脱胶液以1 15的比例混合，并在 90°C的条件下处理2小时，其中过氧化物的用量为亚麻纱线的2%，尿素用量为亚麻纱线的 0. 05%，三聚磷酸钠的用量为亚麻纱线的2%，磷酸钠的用量为亚麻纱线的1%。脱胶后可制的1530支的纺织用亚麻纱线。实施例7亚麻织物生物处理工艺如下将5g灭菌后的亚麻织物置入250ml三角瓶，以亚麻织物与实施例2的发酵菌液发酵菌液按浴比1 20分装于三角瓶中，装液量为100ml，在40°C，200rpm摇床中分别脱胶1 天；脱胶时间到时，除去脱胶液，停止生物处理。将生物处理后的亚麻织物进行灭活处理，其工艺为生物处理后的亚麻织物和脱胶液以1 10的比例混合，并在85°C的条件下处理1小时，其中过氧化物的用量为亚麻织物重量的2. 5%，尿素用量为亚麻织物重量的1%，磷酸钠的用量为亚麻织物重量的3%，乙二胺四乙酸二钠的用量为亚麻织物重量的1%，柠檬酸的用量为亚麻织物重量的1%。脱胶后，亚麻织物白度、柔软度显著改善，刺痒感显著减低。
权利要求
1.一种链格孢菌(Alternaria alternata)DB2菌株，其18S rRNA基因序列，如下CTGGACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAAC TTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAAT TCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTT GTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGC CGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTT TCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCA。
2.一种链格孢菌DB2菌株的制备方法，包括(1)将腐烂海草按Ig 20ml的比例置于富集培养基中，室温静置培养30天，然后取 0. Iml富集培养基涂布于分离培养基中，30°C静置培养1 4天，获得野生型亚麻生物处理菌株；(2)将步骤(1)中得到的菌株接种到亚麻木质素营养培养基中，28°C培养72h;(3)从上述亚麻木质素营养培养基中选择出具有降解木质素能力的菌株，即得。
3.根据权利要求2所述的一种链格孢菌DB2菌株的制备方法，其特征在于所述步骤 (1)中的富集培养基配方为亚麻粉5g，自来水200ml，pH自然；分离培养基配方为亚麻粉 5g，(NH4) 2S045g，K2HPO4Ig, MgSO4O. 5g，KCl 0. 5g，FeSO4O. 01，琼脂 20g，水 lOOOmL，pH 值为 7-7. 2。
4.根据权利要求2所述的一种链格孢菌DB2菌株的制备方法，其特征在于所述步骤 ⑵中的亚麻木质素营养培养基的组分包括亚麻木质素2g，NaN033g，K2HPO4O. 5g,MgSO4Ig, 琼脂 20g，水 IOOOmL, pH 值为 7-7. 2。
5.一种链格孢菌DB2菌株在过氧化物脱胶制备纺织用亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维的工艺中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种链格孢菌DB2菌株及其制备和应用，其制备方法，包括(1)将腐烂海草置于富集培养基中，室温静置培养，然后取富集培养基涂布于分离培养基中，30℃静置培养1～4天，获得野生型亚麻生物处理菌株；(2)将步骤(1)中得到的菌株接种到亚麻木质素营养培养基中，28℃培养72h；(3)从上述亚麻木质素营养培养基中选择出具有降解木质素能力的菌株，即得；该菌株可应用于过氧化物脱胶制备纺织用亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维工艺中。本发明的菌株生长周期短，菌种不易被污染，处理成本低，反应条件温和，抗污染能力强，耐热性能好，无环境污染，处理后纤维质量好；本发明的工艺简单、适合大规模工业化生产。
文档编号C12N1/02GK102329736SQ201110253318
公开日2012年1月25日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者丁若垚, 刘国亮, 张兴群, 董政娥, 郁崇文, 郑磊 申请人:东华大学