一种用于链格孢毒素检测的多功能净化柱及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多功能净化柱的制作和使用方法，尤其涉及一种用于链格孢毒素 检测的多功能净化柱及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 真菌毒素（Mycotoxin)是由真菌产生的次级代谢产物。它们在农作物产品、食品 及饲料中的污染情况日趋严重，对人和动物的健康造成了极大的危害。其中，由链格孢菌 (Alternaria spp)产生的链格孢毒素是全球范围内发生率较高的一类真菌毒素。它广泛污 染果蔬、小麦、油料种籽等农产品及其初级加工品，其中在果蔬及其制品中检出率较高。这 可能是由于果蔬贮藏过程中链格孢菌能在低温下生长繁殖且产生毒素，此外链格孢菌还可 使有些果实内部腐烂而表皮无明显变化。而在果蔬汁等加工制品生产过程中，主要是通过 剔除表面可见的腐烂部分降低毒素及病菌污染的风险，但这并不能完全消除风险隐患。
[0003] 链格孢毒素主要包括5种：交链孢酚（A0H)，交链孢酚单甲醚（AME)，细交链格孢酮 酸（TeA)，交链孢烯（A0H)，腾毒素（TEN)。
[0004] 最近欧洲食品安全局（EFSA)对食品中链格孢毒素的潜在风险进行评估，研宄结 果表明，随膳食摄入的链格孢毒素对公众健康存在潜在风险，目前已开始着手制定链格孢 毒素的最大残留限量标准。尽管我国较早的研宄表明，进食受链格孢毒素污染的小麦与该 地区食管癌高发病率密切相关。然而，由于链格孢毒素检测技术较落后及对实验动物的急 性毒性较弱，长期以来未引起科学界的重视。
[0005] 目前报道的农产品及食品中链格孢毒素的检测方法主要采用液相色谱法（HPLC)、 液相色谱法-质谱法（HPLC-MS/MS)等。此类方法前处理操作繁琐，难以满足现场的、大批 量样品的快速检测；而且检测成本高，同时A0H和AME回收率偏低。
[0006] 而有关多功能净化柱的描述：
[0007] 在CN201410001661.6(公开号为CN103954714A，黄曲霉毒素）和 CN201410835645. 7 (公开号为CN104502481A，呕吐霉素和玉米赤霉烯酮）提到了 mycosep?228多功能净化柱。但Mycosep?228主要应用于农产品中黄曲霉毒素、展青霉素 的多功能净化柱，目前未见针对链格孢毒素开发的多功能净化柱。
[0008] 另外，CAPCELL PAK CR Strong Cation Exchange&Reversed Phase 强阳离子交换 与反向粒子混合柱CAPCELL PAK CR是2007年最新推出的产品之一，是将阳离子交换填料 SCX与C18包被型填料按一定比例混合（SCX :C18 = 1 :50,1 :20和1 :4三种）制成的。可 实现离子和亲水性化合物在LC/MS上的同时分离。但经验证，C18填料对于链格孢毒素有 较强的吸附能力，按照多功能净化柱适用的方法使用时，回收率低（低于20% )，因此该产 品不适用于链格孢毒素的净化。
[0009] 因此，有必要建立高效且可靠的分析方法来监控链格孢毒素的发生及污染情况。
【发明内容】
[0010] 本发明的旨在解决现有固相萃取柱技术对链格孢毒素检测净化效果差，回收率 低，并且试剂较为复杂，不能对各种水果、蔬菜、粮食和食品样品进行准确的检测的问题，进 而提出一种用于链格孢毒素检测的多功能净化柱及其使用方法。
[0011] 本发明提供了一种用于链格孢毒素检测的多功能净化柱，该净化柱包含以下部 件：反相色谱填料、阳离子交换色谱填料。
[0012] 具体的，所述多功能净化柱中：反相色谱填料与阳离子交换色谱填料的体积比为 1 :1-5 :1〇
[0013] 优选地，所述多功能净化柱中：反相色谱填料与阳离子交换色谱填料的体积比为 1 :1-3 :1〇
[0014] 本发明所述的多功能净化柱中，还含有筛板，筛板至少有一层，将反向色谱填料与 阳离子交换色谱填料用筛板隔开。
[0015] 优选地，所述筛板有三层，在两个填料中间、两边均有一层。
[0016] 上述多功能净化柱中：
[0017] 所述反相色谱填料为HLB，其主要成分为N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物， 其粒径优选为40-60 y m。
[0018] 所述阳离子交换色谱填料为MCX，其粒径优选为40-60 y m。
[0019] 所述筛板为10-30微米孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板。
[0020] 本发明还提供了上述多功能净化柱的制备方法，具体为：在筛板上加入阳离子交 换色谱填料，再加入一层筛板，在此筛板上加入反向色谱填料，其上再加一层筛板，压紧，即 得多功能净化柱。
[0021] 本发明还提供了上述多功能净化柱在净化链格孢毒素方面的应用。
[0022] 所述净化包括链格孢毒素穿漏法和链格孢毒素吸附法。其中：
[0023] 所述链格孢毒素穿漏法：将含链格孢毒素的提取液直接加入多功能柱，收集过柱 后的提取液，提取液中的杂质被多功能柱保留；或
[0024] 所述链格孢毒素吸附法：将含链格孢毒素的提取液转换成水相溶液，加入多功能 柱，链格孢毒素保留在多功能柱上，最后通过甲醇等有机溶剂洗脱。
[0025] 净化时，多功能净化柱与样本溶液的体积比为1 :10_1 :30。
[0026] 本发明还提供了上述多功能净化柱净化样品在净化其他中性或酸性的毒素方面 或在检测链格孢毒素方面的应用。
[0027] 所述其他中性或酸性毒素为赭曲霉毒素、桔青霉素、黄曲霉毒素，对其他中性或酸 性毒素的净化方法优选为穿漏法。
[0028] 所述检测是利用液相色谱串联质谱仪进行分析，通过多反应监测（MRM)方式进行 准确定量。
[0029] 需要说明的是，本发明提供的多功能净化柱在使用时，反相色谱填料和阳离子交 换色谱填料均可以调换位置，或者反向色谱填料在上，或者阳离子交换色谱填料在上。
[0030] 本发明提供的多功能净化柱具有以下有益效果：
[0031] (1)本发明提供的链格孢毒素检测的多功能净化柱，适用于各种水果、蔬菜、粮食、 饲料和食品样品，样品乙腈/水提取后，可直接过柱，净化，也可溶剂转换后以吸附再洗脱 的方式净化，一柱双用。
[0032] (2)本发明提供的链格孢毒素检测的多功能净化柱，包括两种净化机理：反相分 离和离子交换。
[0033] (3)本发明提供的链格孢毒素检测的多功能净化柱，与通用的固相萃取方法相比， 此方法更加简便快捷、节省了样品处理的时间及成本、减少了有机溶剂的消耗量，使毒素检 测的前处理更为方便、高效、标准。
[0034] (4)本发明提供的链格孢毒素检测的多功能净化柱，除适用于链格孢毒素的净化 外，也适用于其他中性或酸性的毒素；
[0035] (5)本发明提供的多功能净化柱较单独使用阳离子交换色谱填料、反向色谱填料 相比，能显著降低基质效应。阳离子交换色谱填料可用于去除碱性和两性化合物杂质，HLB 是亲水-亲脂平衡的吸附剂，其保留机理为反相，可有效去除非极性杂质。而链格孢毒素 为中等极性的物质，因此，两者填料复配可有效去除样本中的杂质，经处理后的样本十分干 净，连续进样后灵敏度不会有明显变化，三重四级杆质谱仪的离子源仍保持干净。此外，若 单独使用阳离子交换色谱填料，只能适用于穿漏法；若单独使用反相色谱填料，净化效果较 差，基质效应较严重，进而降低仪器的灵敏度。
【附图说明】
[0036] 图1为多功能净化柱，其中1为柱管，2为筛板，3为反向色谱填料，4为筛板，5为 阳离子交换色谱填料，6为筛板；
[0037] 图2为多功能净化柱与Waters OasisHLB固相萃取小柱净化效果比较，上面为净 化前，下面的为净化后，右面的三个试管中的液体为Waters OasisHLB固相萃取小柱净化 效果。
【具体实施方式】
[0038] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0039] 聚乙烯或聚四氟乙烯筛板的孔径在市场上购买时只能是范围值的孔径，如 10-30 y m，其平均孔径为22 y m，生产厂家为北京茨维特科技有限公司。
[0040] 同样，反相色谱填料的粒径为40-60 ym，其平均粒径为50 ym，生产厂家为北京茨 维特科技有限公司。
[0041] 实施例1 :多功能净化柱的原料及制备
[0042] 1、原料：
[0043] (1)柱管：6mL的聚丙烯或玻璃柱管，内径12. 7mm ;
[0044] (2)筛板：10-30ym孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板；
[0045] (3)反相色谱填料：200 y L粒径为40-60 y m反