As-pcr法检测抗嘧菌酯柑橘褐斑病菌的引物对和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及检测抗嘧菌酯的柑橘褐斑病菌的引物对及 检测方法。
【背景技术】
[0002] 柑橘是国际上第一大水果，在我国也仅次于苹果的第二大水果，其经济重要性不 言而喻。由交链格孢菌（Alternaria alternata)引起的柑橘链格孢褐斑病主要为害橘类， 橘和柚或橘和橙的杂交柑橘，引起落叶、枯梢和落果，不脱落的果实也因果面的病斑难以上 市销售，是感病柑橘生产中的严重障碍。
[0003] 目前褐斑病的防治主要依赖化学药剂，喃菌醋（通用名：azoxystrobin，商品名 称：Abound、Amistar、Heritage、Quadris、Amistar Admire，中文通用名：安灭达、阿米西 达）是先正达公司开发的甲氧基丙稀酸醋类杀菌剂或strobilurin类似物，是第一个登记 注册的strobilurin类似物。喃菌醋既能抑制菌丝生长又能抑制孢子萌发，并且对真菌分 生孢子的产生也有显著的抑制作用，具有铲除、保护作用，并具有内吸及横向输导等特性， 能有效防治子囊菌、卵菌、接合菌、担子菌和半知菌等真菌引起的病害，如：白粉病、锈病、颍 枯病、网斑病、黑腥病、霜霉病、稻瘟病等，与目前市场上常用的杀菌剂相比，具有杀菌谱广、 杀菌活性高，对非靶标生物和环境安全的特性。目前，嘧菌酯已在72个国家的84个作物上 获得注册，应用于超过400个作物或病害系统中。对葡萄、柑橘、苹果、鳄梨及萌芦和扁桃等 多种作物的采后病害防治都具有明显作用。研宄证明该药剂对柑橘链格孢褐斑病具有良好 的防治效果，并在美国佛罗里达州等地广泛推广。已有研宄也表明，离体条件下嘧菌酯对 中国柑橘链格孢褐斑病菌种群也具有优良的抑制效果，田间试验也证明这类药剂的防治效 果。
[0004] 嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的杀菌剂机制是：药剂与病菌线粒体细胞色素 bcl酶复合体上的Qo(quinol oxidation)位点结合，阻止呼吸电子传递链的电子从细胞色 素 b (Cytb)到细胞色素 c之间的传递，破坏菌体的呼吸作用而导致菌体死亡。尽管此类杀菌 剂作用机制独特、性能优秀，但是该类杀菌剂作用位点单一，靶标位点自发突变频率较高， 在高选择压力下，病原菌极易产生抗药性群体。
[0005] 目前已发现的植物病原菌抗Strobilurin类杀菌剂的抗性机理有以下几种情况： (1)多数情况下，植物病原菌是由于cytb基因143位的密码子由甘氨酸突变成了丙氨酸 (G143A)而获得抗药性。此抗性的产生可能是由于甘氨酸突变为丙氨酸后，抑制剂与cytb 之间的位阻增加，从而使植物病原菌获得抗药性。（2)是由于cytb基因129位的密码子由 苯丙氨酸突变成亮氨酸（F129L)而获得了抗药性，该位点的突变可能造成抑制剂与靶标位 点结合时需要的能量增加而使病原菌对杀菌剂产生了抗药性，但是该机制作用下的抗性没 有G143A普遍，抗性水平也没有G143A的高，如：葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola)。 (3)此外，人们还发现了由于cytb基因上137位密码子由甘氨酸变成精氨酸（G137R)， 使植物病原菌获得QoI类杀菌剂抗药性的情况，如：小麦黄斑叶枯病菌（Drechslera tritici-repentis)ο
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一对引物，用于扩增抗嘧菌酯的柑橘褐斑病菌中Cytb基因 143位氨 基酸发生点突变的目的片段，检测柑橘褐斑病菌是否对嘧菌酯产生耐药。
[0007] 引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 在研宄中发现柑橘褐斑病菌（交链格孢菌）对嘧菌酯的抗性分子机制是Cytb基 因的单个碱基点突变，由G突变为C，导致143位氨基酸从甘氨酸变为丙氨酸。基于这一抗 性分子机制，本发明设计了能特异性地从抗性菌株中扩增出条带的特异性引物对。
[0009] 本发明提供了一种包含所述引物对的AS-PCR法检测试剂盒。该试剂盒除了包括 上述特异性引物对，还包括dNTP、Taq聚合酶、PCR buffer、阳性对照DNA、阴性对照DNA。
[0010] 所述的引物对在AS-PCR法检测抗嘧菌酯柑橘褐斑病菌中的应用。
[0011] 本发明也提供了一种检测抗嘧菌酯柑橘褐斑病菌的方法，包括以下步骤：
[0012] (1)提取待测菌的DNA ;
[0013] (2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物对进行AS-PCR扩增；
[0014] ⑶AS-PCR扩增产物进行凝胶电泳分离，染色；
[0015] (4)结果判断：如出现250bp的条带，说明待测菌株为嘧菌酯抗性菌株，否则，说明 待测菌株为嘧菌酯敏感菌株。
[0016] 所述的 AS-PCR 的反应体系为：以 20 μ L 计，10 XPCR buffer 2.0 μ L，5mmol/L 的 上下游引物各 2.0yL，各浓度为 2.5mmol/L 的 dNTP mixture 2.0yL，5U/yL 的 Taq 酶 0· 2 μ L，200ng/ μ L 的模板 DNA I. 0 μ L，CldH2O 10. 8 μ L。
[0017] 所述的AS-PCR反应条件为：94°C预变性3min，94°C变性40s，65°C退火40s，72°C 延伸lmin，进行40个循环，最后72°C延伸lOmin。研宄证明本发明提供的引物对在65°C的 退火温度下扩增目的片段的特异性最好。
[0018] 本发明具备的有益效果：本发明的引物对是基于病菌对嘧菌酯的抗性分子机制设 计的，特异性强；通过PCR参数的优化，建立了快速检测抗嘧菌酯的柑橘褐斑病菌的等位基 因 PCR法，多次重复证明，与传统的生长速率测定法相比，该方法快速，灵敏，并可实现同一 时间检测若干个菌株的高通量检测，适合用于监测田间抗嘧菌酯菌系的发生和发展动态， 为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的合理使用提供依据，避免盲目用药，减少成本，增加经济效益 和社会效益。
【附图说明】
[0019] 图1为利用ASPF/ASPR引物检测待测菌株AS-PCR凝胶电泳图谱，其中M为DNA Marker ;S为已知喃菌醋敏感菌株的对照（来自湖南栊柑）；R为已知抗性菌株的对照（来 自湖南栊柑）；Z8、Y9、C5、X16、Y7、C4、C19、Y4、Y13、H21、X3、D11 和 Z12 为待测菌株（带字 母Z的菌株为来自浙江瓯柑，带Y的菌株来自云南的栊柑，带C的菌株来自重庆的红橘，带 H的菌株来自湖南栊柑，带X的菌株来自广西贡柑，带D的菌株来自广东贡柑）。