一种快速检测细菌AmpC酶耐药基因CMY-2的诊断方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病原微生物的检测，具体涉及一种用环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)快速检测细菌AmpC酶耐药基因的试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]AmpC酶是β -内酰胺类抗菌药物耐药革兰阴性菌所产的最重要的β -内酰胺酶之一，按Bush分类属于I型内酰胺酶(亦称诱导酶或C类头孢菌素酶)，是导致革兰阴性菌(尤其是阴沟肠杆菌)对第1-3代头孢菌素、单环内酰胺酶、头霉素类及含酶抑制剂的复合制剂耐药的重要原因。按传播的介导方式可以分为质粒介导传播和染色体介导传播两种。质粒介导的AmpC酶其可传递性与高表达的持续性高与染色体介导的AmpC酶，且不仅可发生在同菌种之间，还可以发生在不同菌种之间，从而导致耐药菌株更为广泛传播，严重阻碍了临床治疗。
[0003]从1989年Bauerfeind等报道CMY型质粒AmpC酶以来，新的CMY型质粒AmpC酶基因不断被发现，目前已发现的多达十几种。大量的研宄报道，在大肠埃希菌中发现质粒介导的CMY-2型AmpC酶，而且CMY-2还可以进化为其他耐药基因，如CIT群质粒AmpC酶。
[0004]目前已有产CMY-2型质粒AmpC酶菌株引起医院感染暴发的报道，但是由于目前尚缺乏较为简便易行的检测手段，实际的质粒AmpC酶的流行情况要严重得多。而本发明针对质粒AmpC酶耐药基因设计的特异性扩增引物可以有效特异地扩增0/7-么从而建立起一种简便、快速检测细菌AmpC酶耐药基因的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种用于快速检测细菌AmpC酶耐药基因雄]LAMP试剂盒、以及一种用环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)快速检测细菌AmpC酶耐药基因
的方法。
[0006]本发明所采取的技术方案是:
一种用于快速检测细菌AmpC酶耐药基因O/7-雄] LAMP引物组，其包括一对内引物、一对外引物和一对环引物，核苷酸序列分别如下所示:
内引物 1:5，- CCTGGTAGATAACGGCAACGGTCGTTAATCGCACCATCAC-3，(SEQ ID N0.1)；内引物 2:5，- AGCCGATATCGCCAATAACCACACGTCTTACTAACCGATCCT-3’ (SEQ ID N0.2)；外引物 1:5’ - AGAACAACAGATTGCCGAT-3’ (SEQ ID N0.3)；
外引物 2:5，- GGCCAGTATTTCGTGACC-3’ (SEQ ID N0.4)；
环引物 1:5’ - CGGAATAGCCTGCTCCTG-3’ (SEQ ID N0.5)；
环引物 2:5’ - AGCAAACGCTGTTTGAGC-3’ (SEQ ID N0.6)。
[0007]一种用于快速检测细菌AmpC酶耐药基因雄]LAMP试剂盒，其包括上述用于快速检测细菌AmpC酶耐药基因0/7-雄]LAMP引物组。
[0008]作为优选的，所述引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为6-8:1:3_4。
[0009]作为优选的，所述试剂盒中还含有:DNA聚合酶，LAMP反应液，显色剂，阳性对照和阴性对照。
[0010]作为优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
[0011]作为优选的，所述LAMP反应液含有:10 mM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSCVK溶液、5 mM甜菜碱，四者的体积比为6-8:4-5:2-3:8_10。
[0012]作为优选的，所述显色剂为SYBR GREEN I。
[0013]作为优选的，所述阳性对照为含有细菌AmpC酶耐药基因片段的质粒，所述细菌AmpC酶耐药基因片段如SEQ ID N0.7所示；所述阴性对照为DEPC水。
[0014]一种快速检测细菌AmpC酶耐药基因湖方法，包括如下步骤:
(1)提取待检样品DNA；
(2)利用上述用于快速检测细菌AmpC酶耐药基因0/7-雄]LAMP引物组对待检样品DNA进行等温扩增；
(3)结果判断:在上述反应管中加入1_2μ?显色剂10XSYBRGREEN I，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为细菌AmpC酶耐药基因0/7-么橙色则为非耐药基因CMY-2。
[0015]作为优选的，等温基因扩增反应的25 μ L反应体系含有:内引物各8pmol/>L，外引物各I pmol/^L，环引物各4 pmol/^L，反应液12.5μ?，DNA聚合酶8U，待检DNA 1-100 ng，用灭菌去离子水补齐到25μ? ;等温基因扩增反应的条件为:60-65°C反应55_65min。
[0016]本发明的有益效果是:发明针对细菌AmpC酶耐药基因寺异性设计了 6条引物，与目的基因的6个区域结合，具有较高的特异性，能准确地将细菌AmpC酶耐药基因
与其他非细菌AmpC酶耐药基因区分开来。另外，本发明的试剂盒方便快捷，能在较短的时间内鉴别细菌AmpC酶耐药基因0/7-么不需要昂贵的仪器设备；灵敏度高；特异性好，适合现场检测。
【附图说明】
[0017]图1为本发明对细菌AmpC酶耐药基因以及对非细细菌AmpC酶耐药基因的扩增结果(一:阴性样品，+:细菌AmpC酶耐药基因样本)；
图 2 为实施例 3 的特异性验证结果(l:DEPC，2:C7Z-#-l，3:/^E；4: SMB, 5: CMY-2,6: TEM, 7:1MP, 8: VIM and CMY-2)；
图3为实施例4的LAMP灵敏度实验结果(a::本发明LAMP扩增的电泳结果；b:本发明LAMP扩增的显色结果；其中，I为DEPC，2?10为含有细菌AmpC酶耐药基因0/7-屈勺PMD19-T 质粒，浓度依次为 1.0XlO0、1.0X 101、1.0X 102、1.0X 103、1.0X 104、1.0X 105、1.0X 16拷贝 /yL)。
[0018]图4为实施例4的常规PCR灵敏度实验结果(其中，I为DEPC，2?10为含有细菌AmpC酶耐药基因0/7-雄]pMD19-T质粒，浓度依次为1.0X10。、1.0 X 101、1.0 X 102、1.0Χ103、1.0Χ104、1.0Χ105、1.0Χ106、1.0 X 17 拷贝 /yL)o
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0020]实施例1用于快速检测细菌AmpC酶耐药基因雄]LAMP试剂盒的建立用于快速检测细菌超广谱β -内酰胺酶耐药基因PME-1的LAMP试剂盒，包括以下成分:(I)特异性引物组；(2) DNA聚合酶；(3) LAMP反应液；(4)显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。
[0021](I)特异性引物的设计:
根据细菌AmpC酶耐药基因CMY-2 (GenBank登录号为:(DQ173299)的特异性设计6条特异性引物，序列分别如下:
内引物 1:5，- CCTGGTAGATAACGGCAACGGTCGTTAATCGCACCATCAC-3，(SEQ ID N0.1)；内引物 2:5，- AGCCGATATCGCCAATAACCACACGTCTTACTAACCGATCCT-3’ (SEQ ID N0.2)；外