白假丝酵母菌的lamp检测引物组、检测试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学技术领域，属于真菌品种的检测方法，具体的说是涉及白假丝酵母菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着人类环境、疾病等方面的改变，真菌类感染的发病率呈现逐年上升的趋势。假丝酵母属(Candida Berkhout)是酵母菌中最大的一个属，包括163个种，约占目前已知酵母菌种数的1/3 ;白假丝酵母菌亦称白色念珠菌，是导致真菌感染的重要致病菌之一。白假丝酵母菌广泛分布于自然界，以及正常人体的皮肤、口腔、肠道、肛门、阴道等处，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，为条件致病菌。当机体抵抗力降低或菌群失调时，白假丝酵母菌就会繁殖并改变生长形式侵入人体细胞从而引起疾病。随着获得性免疫缺陷综合征、肿瘤等疾病发病率的上升，以及免疫抑制剂、抗生素及侵入性治疗的广泛应用，使白假丝酵母菌成为常见的感染病原菌。
[0003]白假丝酵母菌细胞呈卵圆形，致病性菌株细胞呈现假菌丝。该菌在血琼脂或沙保氏琼脂上，以37°C或室温孵育2?3d后，生成灰白乳酪样菌落；涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。若接种于4%玉蜀黍琼脂上，室温孵育3?5d可见假菌丝，芽生孢子，厚膜孢子。白假丝酵母菌对热的抵抗力不强，加热至60°C，lh后即可死亡。但对干燥、日光、紫外线及化学制剂等抵抗力较强。
[0004]白假丝酵母菌引起浅表性感染和深部感染，引起的相关疾病有皮肤念珠菌病，包括指趾间糜烂，多见于长期从事潮湿作业的人、念珠菌性间擦瘆多见于小儿和肥胖多汗者、丘瘆形念珠菌病多见于肥胖儿童、念珠菌性甲沟炎、甲床炎等多见于指甲；粘膜念珠菌病，多见于婴幼儿患者的鹅口疮以及生殖器念珠菌病；而深部感染疾病则包括内脏念珠菌病，该感染可累及全身所有内脏器官，其中以肠念珠菌病及肺念珠菌病较常见。此外还可引起泌尿道炎、肾孟肾炎、心内膜炎及脑膜炎等，偶见其引发念珠菌性败血症。念珠菌瘆，即念珠菌及其代谢产物引起的皮肤变态反应，主要损害为成群的无菌性水疱，多见于手指间；也可见到银肩病样、玫瑰糠瘆样、脂溢性皮炎样、荨麻瘆样、离心性环状红斑样损害。
[0005]由此可见，开展白假丝酵母菌快速检测方法的研宄具有十分重要的意义。目前有关白假丝酵母菌快速检测的方法主要分为2种:
I)以微生物培养为主的传统检测方法。首先增菌培养，取供试液1ml直接或处理后接种至适量的沙氏葡萄糖液体培养基中，培养48?72h。然后取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养24?48h，必要时延长至72h，根据菌落形态初步判定。
[0006]2)以定性PCR和实时定量PCR检测方法为基础的分析法。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，通过聚合酶的作用，在体外快速特异地扩增目的片段，微量、特定的目的DNA片段在几小时内迅速扩增到百万倍，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后很容易观察鉴别，具有快速、灵敏等优点。
[0007]然而，上述2种检测方法存在检测周期长、检测体系和操作过程比较复杂，难以实行现场检测等问题，且需要专业人员操作；PCR仪价格在5万元左右，扩增需要2?3小时，电泳检测需要I小时左右；电泳常用染料EB为强致癌物质，有较强毒性。因此，在科学研宄和生产实践中均需要一种快速简便、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的检测方法。
[0008]环介导等温基因扩增技术(Loop-MediatedIsothermal Amplificat1n，以下简称LAMP法)是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、容易普及、安全可靠的优点，可是目前尚未有将LAMP法应用于快速检测白假丝酵母菌的试剂盒。
【发明内容】
[0009]本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种白假丝酵母菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒以及一种基于上述检测引物组和检测试剂盒的白假丝酵母菌的恒温基因扩增检测方法。
[0010]本发明是通过以下技术方案实现的:一种白假丝酵母菌的LAMP检测引物组，其包括外引物I和外引物2、内引物I和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示:
外引物 1:TAAGTATTTGGGAGAAGGGA (SEQ ID No:1)；
外引物 2:AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA (SEQ ID No:2)；
内引物 1:CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA (SEQ ID No:3);内引物 2:GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG (SEQ ID No:4)。
[0011]一种白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒，其包括以下成分:
(1)引物液:含有权利要求1所述的白假丝酵母菌的LAMP检测引物组，所述引物液中各引物的浓度分别为48?52 μ M外引物1、48?52 μ M外引物2，48?52 μ M内引物1、48?52 μM内引物2 ；
(2)反应液:含有12mM dNTP、10X Isothermal Amplificat1n 反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液，所述dNTP、反应缓冲液和MgSO4水溶液的体积比是7?9:4?6:2 ;
(3)DNA聚合酶:DNA聚合酶的浓度为7?9U/ μ I ;
(4)对照:阳性对照为白假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
[0012]作为本发明的优选实施方案:引物液中含有50μΜ外引物1、50μΜ外引物2，50 μ M内引物1、50 μ M内引物2。DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，Bst DNA翁合靡的浓度为8U/ μ I ο 反应液中 12mM dNTP: 10 X Isothermal Amplificat1n 反应缓冲液:150mM MgSO4水溶液的体积比为8:5:2。
[0013]一种白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒检测白假丝酵母菌的检测方法，包括如下步骤:
1)待检样品DNA的提取:采用煮沸法提取白假丝酵母菌纯化样品DNA;
2)恒温检测反应:在PCR管中配制反应体系:引物液1.8 μ 1，反应液15.2μ1，DNA聚合酶 I μ 1，待检DNA I ?6μ1，用 DNase/RNase-Free Distilled Water 补齐到 25 μ I ;设置阳性对照反应时，用白假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C条件下持续2min ；
3)结果判断:通过观察PCR管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。
[0014]作为本发明进一步的方案:检测试剂盒还含有显色剂，显色剂为荧光染料Calcein0
[0015]一种白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒检测白假丝酵母菌的检测方法，包括如下步骤:
1)待检样品DNA的提取:采用煮沸法提取白假丝酵母菌纯化样品DNA;
2)恒温检测反应:在200μ I PCR管中配制反应体系:引物液1.8 μ 1，反应液15.2μ1，DNA 聚合酶 I μ 1，待检 DNA I ?6 μ 1，用 DNase/RNase-Free Distilled Water 补齐到25 μ I ;设置阳性对照反应时，用白假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于60?65°C反应45?90min，并在80°C条件下持续2min ；
3)结果判断:在上述PCR管中加入I?2μI显色剂，混匀，根据显色结果来判断扩增结果。
[0016]作为本发明进一步的方案:检测试剂盒还含有荧光指示剂，荧光指示剂为SYT0-9。
[0017]一种白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒检测白假丝酵母菌的检测方法，包括如下步骤:
1)待检样品DNA的提取:采用煮沸法提取白假丝酵母菌纯化样品DNA;
2)恒温检测反应:在200μ I PCR管中配制反应体系:引物液1.8 μ 1，反应液15.2μ I,DNA 聚合酶 I μ I，荧光指示剂 SYT0-9 I μ I，待检 DNA I ?6 μ I，用 DNase/RNase-FreeDistilled Water补齐到25 μ I ;设置阳性对照反应时，用白假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ;将配制好的PCR管混匀后离心，并于实时荧光检测仪(如qPCR仪等)在60?65°C反应45?90min，并在80°C条件下持续2min ；
3)结果判断:根据是否出现S型扩增曲线判断扩增结果。
[0018]本发明中采用煮沸法提取白假丝酵母菌纯化样品DNA的方法为:(I)在待测样品中加入3倍体积的4%的NaOH或NALC-NaOH ；(2)涡旋振荡混匀，室温下放置15 min，然后吸取I ml加入带旋盖的离心管中；(3) 12000 rpm离心10 min，去上清液；(4)加入0.9%的NaCl或生理盐水I ml，混勾，12000 rpm离心10 min，去上清液；(5)加入100 μ I的DNA提取液；(6) 100°C加热10 min，加热后迅速冷却(置于_20°C冰箱)10 min ；(7) 12000 rpm离心2 min，将上清转移至新的离心管中备用。
[0019]dNTP为脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括dATP，dGTP, dTTP, dCT