一种异尖线虫虫体过敏原pcr检测技术的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种异尖线虫虫体过敏原PCR检测技术。
【背景技术】
[0002] 异尖科线虫是鱼类寄生线虫中最大的科，成虫寄生在海洋哺乳动物的体内，幼虫 寄生在鱼类或软体动物中，人食入含有活的某些异尖科线虫幼虫的食物，可引起异尖线虫 病。
[0003] 随着吃海鲜、海产加工品等饮食时尚的兴起和渔业、旅游业的发展，异尖线虫作为 海产食品中的一种重要的食源性寄生虫病，对人们生命健康存在在着巨大威胁。不仅活的 异尖线虫虫体可以引起异尖线虫病导致急腹症和过敏症，引发荨麻瘆过敏性反应，严重的 可引起死亡案例。由于异尖线虫虫体中含有许多耐热性、耐胃蛋白酶活性的过敏原，经高温 和胃液处理的死亡虫体也可以引起过敏反应。Shimakura用凝胶过滤，快速液相色谱和反 相高效液相色谱法异尖线虫幼虫中提纯纯化出1种分子量为21kDa的热稳定性过敏原，7/8 的病人对其有过敏反应。Moneo在异尖线虫幼虫E/S蛋白质中提取出了一种分子量为9kDa 的热稳定性过敏原，将其加热后，一些病人仍然对其有反应。因此即使食用了经过高温处理 的含有虫体成分的鱼或罐装产品也会出现过敏性症状。
[0004] 2006年Armentia等报道了一起人由于食用鸡肉造成的异尖线虫过敏症的病例， 由于现在的食品加工业用到的鱼粉是在高温下制作的，说明此病例是由于耐热性的过敏原 引起的。
[0005] 异尖线虫在海产鱼类和头足类等中普遍存在，寄生于内脏和肌肉之中。由于异尖 线虫虫体颜色较鱼肉相近，在鱼类和头足类肉制品加工中极有可能混入鱼肉原料，经过高 温煎炸加工制成各种各样产品，如鱼糜、鱼罐头、鱼丸、鱼肉排、鱼肉肠、腌制鱼、烟熏鱼等产 品。但因为这些产品中含有异尖线虫虫体过敏原，所以食用这些产品极大可能导致过敏症 发生。
[0006] 我国东接渤海、黄海、东海、南海四大海域，海洋渔产丰富，海岸线上人群密集，且 居民素有食用海洋食品品的习惯，海产品及其加工品消费量巨大，其健康安全与否危及千 家万户，由于其异尖线虫虫体成分所引起的过敏性症状和其他症状非常相似，单凭临床诊 断较为困难，而且也极易引起误诊和漏诊。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于为了解决现有由于异尖线虫虫体成分所引起的过敏性症状难 以确诊的缺陷而提供一种高质量的异尖线虫虫体成分检测方法可以降低异尖线虫传给人 类的风险一种异尖线虫虫体过敏原PCR检测技术。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种异尖线虫虫体过敏原PCR检测技术，包括如下步骤： a)对异尖线虫DNA提取； b) 引物设计： 上游引物 ANISAKIS COI F:5' 一GGKCYATTAAYTYTATRACWACTAC-3'（SEQ ID N0.1) 下游引物 ANISAKIS COI R5' 一AAAGAWGTATTMARRTTACGRTCVG-3'（SEQ ID N0.2) 退火温度为54. 5°C，预期扩增片段大小为178bp ; c) 对步骤b)的引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶上电泳，观察结果； d) 分别进行特异性试验、敏感性试验进行验证。
[0009] 作为优选，步骤a)中DNA提取是将甘油中保存的异尖线虫用蒸馏水洗净后，应用 Wizard'1* Magnetic DNA Purification System for Food 试剂盒进行 DNA 的提取。
[0010] 作为优选，步骤C)中PCR反应体系各试剂加入量为：10XPCR buffer 2 μ L、 dNTPL 6 μ L、上游引物 0· 4 μ L、下游引物 0· 4 μ L、DNA 模板 I μ L、ddH20 14 μ L、Taq 酶 0· 1 μ L，总体积 20 μ L。
[0011] 作为优选，扩增程序：94°C 5min - 94°C 30sec，54°C 30sec，72°C lmin，30 个循环 -72°C lOmin。应用设计的引物对异尖线虫DNA进行PCR反应。
[0012] 作为优选，特异性试验为以简单异尖线虫代表异尖科线虫，提取DNA，分别用颚口 线虫、捻转血矛线虫和鱼肉DNA作对照，按步骤b)与c)的PCR检测方法进行扩增，琼脂糖 凝胶电泳分析结果。
[0013] 作为优选，敏感性试验是以3. 6ng/ μ L的简单异尖线虫DNA为模板，连续十倍浓度 梯度稀释，稀释次数为8次，将不同浓度的DNA进行PCR扩增，电泳分析结果。
[0014] 作为优选，鱼肉取自带鱼、马鲛鱼、鲭鱼、秋刀鱼、竹荚鱼、黄鲇鱼、黑线鳕鱼、黑鯛 鱼与黑盲鳗。
[0015] 本发明的有益效果： 本发明建立了的PCR检测体系，通过该方法的建立来弥补形态学及免疫学检测的缺 陷，提高检测方法的特异性及敏感性，可以用于检测含有过敏原虫体的鱼或鱼加工产品检 测，并为其生活史、传播方式及危害程度的研宄提供有效的技术支撑。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明特异性试验的电泳图。图中，M :IOObp DNA Marker ;1:简单异尖线 虫；2 :颚口线虫；3 :捻转血矛线虫；4-11 :带鱼、马鲛鱼、鲭鱼、秋刀鱼、竹荚鱼、黄鲇鱼、黑 线鳕鱼、黑鯛鱼、黑盲鳗。
[0017] 图2是本发明敏感性试验的电泳图。
[0018] 图中，M :100bp DNA Marker ;1 :360pg/yL 简单异尖线虫 DNA ;2 :36pg/yL 线 虫 DNA ;3 :3. 6pg/ μ L 线虫 DNA ;4 :0· 36pg/ μ L 线虫 DNA ;5 :0· 036pg/ μ L 线虫 DNA ;6 : 0· 0036pg/ μ L 线虫 DNA ;7 :0· 00036pg/ μ L 线虫 DNA ;8 :0· 000036pg/ μ L。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发 明的实施例并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将 落入本发明保护范围。
[0020] 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0021] 鱼体与线虫来源：黑线鳕鱼、带鱼、鲭鱼、安康鱼样品和A. typica(典型异尖线 虫）、Pseudoterranova decipiens (伪地新线虫）、A. physeteris (抹香鲸异尖线虫）、 A. simplex (简单异尖线虫）、R. trichiuri (针蛔线虫）、C. muraenesoxi (灰海饅对盲囊线 虫）、颚口线虫、捻转血矛线虫等虫体由舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心动植物实 验室保存。
[0022] Wizard1* Magnetic DNA Purification System for Food 试剂盒、10 XPCR Buffer、dNTP、Taq酶和限制性内切酶BamH I，Hindm试剂，T4DNA连接酶购自Takara公 司；DNA片断回收试剂盒为东盛公司产品；pMD18-T载体购自上海生工生物技术公司。
[0023] 实施例 一种异尖线虫虫体过敏原PCR检测技术，包括如下步骤： a) 对