BRCA1基因g.41244291delT突变及其在乳腺癌辅助诊断中的应用
【专利说明】BRCA1基因 g. 41244291 de IT突变及其在乳腺癌辅助诊断中 的应用 发明领域
[0001] 本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及BRCAl基因 g. 41244291delT突变及其 在乳腺癌辅助诊断中的应用。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是全球第二大常见恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中居首位。据世界卫生组织 国际癌症研宄中心统计，2012年全球女性乳腺癌新发病例达167万，占全部女性恶性肿瘤 发病的25%。同时乳腺癌是全球第五位常见的恶性肿瘤死亡原因，居女性恶性肿瘤死亡原 因之首，全球共52万人因乳腺癌死亡，占所有女性恶性肿瘤死亡的14. 7%。而2012年，中 国女性乳腺癌新发病例18. 7万，发病人数仅次于肺癌，其中4. 8万女性因乳腺癌死亡，居女 性恶性肿瘤死亡的第六位。
[0003] 乳腺癌是具有很强遗传背景的恶性肿瘤，5-10%的乳腺癌是因为携带高外显率的 乳腺癌易感基因突变所致。BRCA1，BRCA2, TP53, PALB2, PTEN，CHEK2, ATM，RAD50等被认定 为乳腺癌易感基因，携带这些基因胚系突变的乳腺癌被称为遗传性乳腺癌，其中至少10% 的遗传性乳腺癌是由于BRCAl突变所致。
[0004] 突变位点的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治 疗等因素的不同反应性，因此突变位点可能是导致个体对常见疾病发病易感性差异的重要 遗传基础。将疾病的突变位点谱用于疾病的辅助诊断，具有广阔的应用前景。近年来，利用 突变位点对疾病进行辅助诊断已经成为临床和科研工作者的研宄热点，在肿瘤、先天性疾 病和心脑血管疾病等常见重大疾病上的应用价值已初见端倪。
[0005] 携带BRCAl功能性突变的个体极有可能发展为乳腺癌患者，尤其是乳腺癌家族史 携带者。针对突变携带者采取一系列的预防措施，例如较早的进入乳腺癌筛查，并提高筛 查频率，以及预防性手术的实施将早期发现乳腺癌而取得较好的干预和治疗效果。中国的 BRCAl基因检测起步较晚，尽管有几项相关的研宄，但是尚未发现足够量的突变"热点"，尤 其是中国人群特异的乳腺癌相关突变。并且由于种族差异，欧美国家的突变谱也不完全适 用于中国人群，若能筛选出乳腺癌发病相关的突变位点作为生物标志物，并研制相应的诊 断试剂盒，对我国乳腺癌筛查和早期诊断必将是一次有力的推动。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种具有新的突变位点的BRCAl突变基因。
[0007] 本发明另一个目的是提供检测上述突变位点的特异性引物。
[0008] 本发明第三个目的是提供上述BRCAl突变基因及特异性引物在制备乳腺癌辅助 诊断试剂盒中的应用。
[0009] 本发明第四个目的是提供一种乳腺癌辅助诊断试剂盒。
[0010] 发明人通过分离和研宄乳腺癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA中的 突变，寻找与乳腺癌相关的高特异性的突变位点，并研制出可临床或人群应用的乳腺癌辅 助诊断试剂盒，为乳腺癌的筛查和诊断提供支持。
[0011] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
[0012] 一种用于乳腺癌辅助诊断的BRCAl突变基因，该突变基因与BRCAl正常基因序列 相比具有g. 41244291delT位点移码突变。
[0013] 用于检测上述BRCAl基因的突变位点的特异性测序引物，其上游引物的序列如为 SEQ ID NO. 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0014] 用于检测上述BRCAl基因的检测方法，该方法采用Sanger测序方法，使用PCR扩 增引物，对BRCAl基因进行突变检测；其中PCR扩增引物的上游引物的序列如为SEQ ID NO. 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0015] 上述的BRCAl突变基因在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
[0016] 上述的引物在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
[0017] -种乳腺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测BRCA1基因是否具有 g. 41244291delT位点移码突变。
[0018] 所述的试剂盒，该试剂盒含有上述引物（上游引物的序列如为SEQ ID NO. 3所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO. 4所示），该试剂盒还可以含有PCR技术所需的常用试剂。
[0019] 具体地说
[0020] 本发明采用Sanger测序技术在70例具有乳腺癌家族史的中国汉族女性乳腺癌患 者中，我们发现有1例患者存在BRCAl基因组第17号染色体的41244291位置发生T碱基 的缺失；随后进行无家族史乳腺癌样本验证，在3000例无家族史中国汉族乳腺癌女性乳腺 癌患者中，存在8例患者携带该突变；在3000例无肿瘤家族史，年龄匹配的正常女性对照人 群中，未发现突变个体。因此，该突变对乳腺癌的阳性预测值为100%，人群家族性乳腺癌患 者中发生率为1. 43%，散发性乳腺癌中发生率为0. 27%。为进一步提高该突变致乳腺癌的 可靠性，我们在2004年建立的中国汉族正常人群队列（排除任何肿瘤患者，排除乳腺癌家 族史患者）中女性7120名（36岁-70岁）检测该突变，发现突变阳性1例（基线时为52 岁），随访至2013年，共发生25例新发乳腺癌患者，其中包含该突变阳性者。该突变位点为 本研宄首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，且在正常人群中不存在该突变，通过纳入 前瞻性队列研宄，证明了携带该突变的患者最终发展成了乳腺癌，证明了该位点是乳腺癌 的致病因素。
[0021] 以上研宄所发现的与乳腺癌辅助诊断相关的突变位点为g. 41244291delT，该突变 发生于第17号染色体的41244291位置，该基因在NCBI参考数据库GRCh37. pl3中的编号 为NC_000017. 10(41196312-41277500)，这里列出在该数据库中本突变位点前后IOObp的 碱基序列供参考，如SEQ ID NO: 1所示，BRCAl基因突变序列对应的序列如SEQ IDNO:2所 示，其中突变位点为在SEQ ID NO: 1序列的第101位由碱基T缺失发生移码突变。
[0022] SEQ ID NO: 1
[0023] GAAGTGGGCTCCAGTATTAATGAAATAGGTTCCAGTGATGAAAACATTCAAGCAGAACTAGGTAGAAAC AGAGGGCCAAAATTGAATGCTATGCTTAGAT1AGGGGTTTTGCAACCTGAGGTCTATAAACAAAGTCTTCCTGGAAG TAATTGTAAGCATCCTGAAATAAAAAAGCAAGAATATGAAGAAGTAGTTCAGACT
[0024] SEQ ID NO:2
[0025] GAAGTGGGCTCCAGTATTAATGAAATAGGTTCCAGTGATGAAAACATTCAAGCAGAACTAGGTAGAAAC AGAGGGCCAAAATTGAATGCTATGCTTAGAT[-]AGGGGTTTTGCAACCTGAGGTCTATAAACAAAGTCTTCCTGGA AGTAATTGTAAGCATCCTGAAATAAAAAAGCAAGAATATGAAGAAGTAGTTCAGACT
[0026] 本发明解决问题的技术方案包括：（I)筛选出人群中BRCAl与乳腺癌发生相关的 新突变，提供位点的突变后碱基序列（2)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程 序（SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。（3)突变筛选 和验证其作用：采用Sanger测序技术在70例具有乳腺癌家族史的中国汉族女性乳腺癌患 者中，我们发现有1例患者存在BRCAl基因的基因组序列中41244291位置T碱基发生缺失 导致移码突变；随后进行无家族史乳腺癌样本验证，在3000例无家族史中国汉族女性乳腺 癌患者中，存在8例患者携带该突变；在3000例无肿瘤家族史，年龄匹配的中国汉族正常女 性对照人群中，未发现突变个体。我们在2004年建立的中国汉族正常人群队列（排除任何 肿瘤患者，排除乳腺癌家族史患者）中女性7120名（36岁-70岁）检测该突变，发现突变 阳性1例（基线时为52岁），随访至2013年，共发生25例新发乳腺癌患者，其中包含该突 变阳性者。（4)对筛选出的突变位点，需要满足在正常人群中无频率。（5)乳腺癌辅助诊断 试剂盒的研制：根据乳腺癌病例所独有的突变位点开发突变位点辅助诊断试剂盒。
[0027] 本发明人以标准操作程序（SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口 学资料、临床资料等，并采用了 Sanger测序对BRCAl基因的外显子编码区域进行扫描。
[0028] 具体来说研宄的实验方法主要包括以下几个部分：
[0029] 1.研宄样本的选择（均为中国汉族）
[0030] (1)经病理学明确诊断的具有乳腺癌家