Brca1基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种BRCA1基因突变检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对A926G位点的SEQ?ID?NO.13及SEQ?ID?NO.14，针对C2077T位点的SEQID?NO.15及SEQ?ID?NO.16，针对A1525G位点的SEQ?ID?NO.17及SEQ?ID?NO.18，针对G53675A位点的SEQ?ID?NO.19及SEQ?ID?NO.20，针对C36048T位点的SEQ?ID?NO.21及SEQ?ID?NO.22，和/或针对C2612T位点的SEQ?ID?NO.23及SEQ?ID?NO.24；有不同anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
【专利说明】BRCA1基因突变检测特异性引物和液相芯片
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种BRCAl基因突变检测特异性引物和液相芯片。
【背景技术】
[0002]BRCAl 基因称为乳腺癌 I (breast cancer I, early onset, BRCA I)，定位于 17 号染色体17q21长臂上，约100个kb，内含高达41.5%的Alu重复序列和4.8%的其它重复序列。含有24个外显子，其中22个转录出716kb mRNA，最终可编码含1863个氨基酸的蛋白质。第11个外显子较大，长314kb，占整个编码区的61 %。BRCAl编码蛋白的N末端序列含有一环状结构域(ring domain),能够与BRCAl相关环状蛋白(BRCA12associated ringdomainprotein, BARD1)组成环2环异二聚体,一般认为BRCAl的N末端在调节RNA合成酶功能方面起着重要作用。BRCAl基因是肿瘤抑制基因家族中的一员。与其它肿瘤抑制基因一样，BRCAl能防止细胞过快或者失去控制地生长和分化。通过对受损的蛋白质进行修复，BRCAl蛋白质在保持DNA处于良好工作状态中发挥了重要的作用。野生型BRCAl编码蛋白在细胞周期调控、DNA损伤修复以及诱导肿瘤细胞凋亡方面发挥着重要作用。但是当BRCAl发生突变时，上述功能不但都会丧失，同时突变的BRCAl还可能通过阻断野生型BRCAl的正常生理功能而大大增加患肿瘤的可能性。研究表明，BRCAl作为抑癌基因，其突变与高乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌的发病率有关。
[0003]目前，BRCAl基因突变检测方法主要有:荧光定量PCR技术，PCR-RFLP技术，直接测序法，荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高的特点，但也存在样品易污染、假阳性率高的缺点，且每次只能检测一种突变类型。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。而直接测序法两端靠近引物的序列容易测不准，测序方法成本高、操作复杂，对于那些突变比例低于15%~20%的标本，如果用测序的方法进行检测，很难发现突变，因此这些检测方法都难以满足实际应用的需要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供BRCAl基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测 BRCAl 基因六种常见基因型 A926G、C2077T、A1525G、G53675A、C36048T 和 C2612T
的野生型和突变型。
[0005]实现上述目的的技术方案如下。
[0006]一种BRCAl基因突变检测液相芯片，包括有:
[0007](A).针对BRCAl基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对A926G位点的SEQ ID N0.13及SEQ ID N0.14，针对C2077T位点的 SEQ IDN0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 A1525G 位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，针对 G53675A 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20，针对 C36048T 位点的 SEQ ID N0.21及 SEQ ID N0.22，和 / 或针对 C2612T 位点的 SEQ ID N0.23 及 SEQ ID N0.24 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQ IDN0.12 ；
[0008](B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.25~SEQ IDN0.36,且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
[0009](C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
[0010]在其中一个实施例中，所述扩增引物为:针对A926G位点的SEQ ID N0.37及SEQID N0.38，针对 C2077T 位点的 SEQ ID N0.39 及 SEQ ID N0.40，针对 A1525G 位点的 SEQ IDN0.41 及 SEQ IDN0.42，针对 G53675A 位点的 SEQ ID N0.43 及 SEQ ID N0.44，针对 C36048T位点的 SEQ ID N0.45 及 SEQ ID N0.46，和 / 或针对 C2612T 位点的 SEQ ID N0.47 及 SEQ IDN0.48。
[0011]在其中一个实施例中，所述ASPE引物对为:针对A926G位点的由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.13组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.14组成的序列，针对C2077T位点的由SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.16组成的序列，针对A1525G位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.17组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.18组成的序列，针对G53675A位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.19组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.20组成的序列，针对C36048T位点的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.21组成的序列及由SEQ IDN0.10和SEQ ID N0.22组成的序列，和/或针对C2612T 位点的由 SEQ ID N0.11 和 SEQ ID N0.23 组成的序列及由 SEQ ID N0.12 和 SEQ IDN0.24组成的序列。`
[0012]本发明的另一目的是提供用于BRCAl基因突变检测的特异性引物。
[0013]实现该目的的技术方案如下。
[0014]用于BRCAl基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物为针对A926G位点的SEQ IDN0.13 及 SEQ ID N0.14，针对 C2077T 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对A1525G 位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，针对 G53675A 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQID N0.20，针对 C36048T 位点的 SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22，和 / 或针对 C2612T 位点的SEQ ID N0.23 及 SEQID N0.24。
[0015]本发明的主要优点在于:
[0016]1.本发明所提供的BRCAl基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的BRCAl基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
[0017]2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
[0018]3.本发明的检测方法步骤简单，6种突变位点检测可通过一步PCR即可完成6条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
[0019]4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
【具体实施方式】
[0020]实施例1BRCAl基因突变检测液相芯片，主要包括有:
[0021]一、ASPE 引物
[0022]针对BRCAl 基因六种常见基因型 A926G、C2077T、A1525G、G53675A、C36048T 和C2612T的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
[0023]表1BRCAl基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)
[0024]
【权利要求】
1.一种BRCAl基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有: (A).针对BRCAl基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对A926G位点的SEQ ID N0.13及SEQ ID N0.14，针对C2077T位点的SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 A1525G 位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，针对G53675A 位点的 SEQ IDN0.19 及 SEQ ID N0.20，针对 C36048T 位点的 SEQ ID N0.21 及 SEQID N0.22，和/或针对C2612T位点的SEQ ID N0.23及SEQ ID N0.24 ;所述tag序列选自SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.12 ； (B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.25~SEQ ID N0.36，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的BRCAl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为:针对 A926G 位点的 SEQ ID N0.37 及 SEQ ID N0.38，针对 C2077T 位点的 SEQ ID N0.39 及SEQ IDN0.40，针对A1525G位点的 SEQ ID N0.41 及 SEQ ID N0.42，针对G53675A位点的 SEQID N0.43 及 SEQ ID N0.44，针对 C36048T 位点的 SEQ ID N0.45 及 SEQ ID N0.46，和 / 或针对 C2612T 位点的 SEQ ID N0.47 及 SEQ ID N0.48。
3.根据权利要求1或2所述的BRCAl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物对为:针对A926G位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.13组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.14组成的序列，针对C2077T位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ IDN0.4和SEQ ID N0.16组成的序列，针对A1525G位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.17组成的序列及`由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.18组成的序列，针对G53675A位点的由SEQ ID N0.7和SEQID N0.19组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.20组成的序列，针对C36048T位点的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.21组成的序列及由SEQ IDN0.10和SEQ ID N0.22组成的序列，和/或针对C2612T位点的由SEQ ID N0.11和SEQ IDN0.23组成的序列及由SEQ ID N0.12和SEQ IDN0.24组成的序列。
4.根据权利要求1或2所述的BRCAl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10 个 T0
5.用于BRCAl基因突变检测的特异性引物，其特征是，所述特异性引物为针对A926G位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，针对 C2077T 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 A1525G位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，针对 G53675A 位点的 SEQ ID N0.19 及SEQ ID N0.20，针对 C36048T 位点的 SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22，和 / 或针对 C2612T 位点的 SEQ ID N0.23 及 SEQ ID N0.24。
【文档编号】C12Q1/68GK103865985SQ201210545608
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月14日 优先权日:2012年12月14日
【发明者】吴诗扬, 邹凤文 申请人:益善生物技术股份有限公司