一种简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种简单异尖线虫Ani?s4抗原基因的克隆和表达方法。本发明以简单异尖线虫第三期幼虫总RNA为模板，用RT-PCR的方法扩增得到500bp大小的特异片段，将扩增产物克隆至pMD18-T转化感受态菌DH5-α,经酶切鉴定获得阳性重组质粒，然后将重组质粒和表达载体pET-32a分别以BamHI和HindШ双酶切后构建重组表达载体pET-32a-Ani-s4，并将其转化入大肠杆菌BL21中，提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后，用IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测显示，融合蛋白的分子量约为25kDa，Ani?s4基因在大肠杆菌中成功表达。同时所构建的表达蛋白具有的His-tag为其后的纯化工作提供了极大的便利。该ES抗原蛋白的成功表达，为后续的简单异尖线虫免疫学检测方法的研究奠定了基础。
【专利说明】一种简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达方法。
【背景技术】
[0002]排泄分泌抗原(ES抗原)是在寄生虫的感染过程中，由其口器和排泄孔分泌或排泄的抗原物质。线虫的ES系统有许多功能，包括渗透调节、离子调节及排泄、分泌等。分泌的物质在体外可以降解细胞基质，破坏宿主组织，引起临床的过敏反应，如麻疹和水肿。运用分子克隆技术获得纯化的重组寄生虫抗原，其有效性和特征性已经在许多寄生虫感染的诊断中得到了印证。这些合成的蛋白包括了寄生生活及感染过程中的分泌排泄抗原一 ES抗原。
[0003]相关研究表明，简单异尖线虫三期幼虫可以侵入宿主的胃肠黏膜释放ES蛋白。Anis4是简单异尖线虫的一个抗原基因，相关研究结果显示，体外表达的该蛋白具有ES蛋白性质，其具有高度的耐热性，表达的抗原中不包含糖基化作用。该抗原蛋白经过长时间的加热，仍然能够识别在人体病原感染病例中的阳性血清样本，所以研究认为该蛋白与临床检测相关。在应用该抗原检测人体感染病例研究中，显示Ani s4表达抗原能与大部分病人血清产生特异反应。天然的ES蛋白获得具有非常大的难度，且国内尚无Ani s4基因体外表达的相关方法报道。鉴于Ani s4基因的抗原特性以及表达ES蛋白良好的免疫原性和保护效果，本发明研究对其进行克隆和表达，作为深入研究简单异尖线虫相关检测的工具。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达方法。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0006]一种简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达方法，包括如下步骤:
[0007]①简单异尖线虫总RNA的提取，
[0008]②简单异尖线虫Ani s4抗原基因的RT-PCR扩增，
[0009]根据Ani s4抗原基因其阅读框的序列特点，在序列的两端分别加上BamH I和Hind ΠΙ酶切位点设计引物，同时增加保护性碱基；设计的引物如下:
[0010]上游引物5，一CGGGATCCATGCAATCCAGAATCGTCGT—3，(SEQ ID N0.1),
[0011]下游引物5’ 一CCCAAGCTTGCAAACAAGCCAGTGTCATA— 3’ (SEQ ID N0.2),
[0012]以步骤①提取的总RNA为模板，反转录出单链cDNA，经PCR扩增，获得目的基因Anis4，
[0013]③将纯化后的目的基因PCR产物和pMD18-T载体进行连接，获得重组质粒pMD18-T-Ani_s4 ；
[0014]④原核表达载体的构建和鉴定:
[0015]BamH I和Hindm双酶切质粒pMD18-T-Ani_s4和质粒pET_32a，回收所需目的片段，加入T4DNA连接酶进行连接；将连接产物转化感受态细胞，抽提质粒；再应用质粒转化大肠杆菌，BamH I和Hindm双酶切筛选阳性克隆，命名为pET32a-Ani_s4 ；
[0016]⑤IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白，
[0017]含重组表达质粒的菌种活化后，将阳性菌接种到含Amp的LB液体培养基中，37°C振荡培养至菌液的OD值为0.5-0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为lmmol/L后34°C继续振荡培养进行诱导表达；
[0018]诱导表达后通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达。
[0019]作为优选，IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白的具体步骤如下:
[0020]含重组表达质粒的菌种活化后，取Iml阳性菌接种到50mL含Amp的LB液体培养基中，于37°C摇床中以195rpm振摇培养，至菌液的OD值约为0.5-0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为lmmol/L后34°C继续振荡培养，分别在诱导前(Oh)和诱导后2、4、6、8h吸取2mL菌样于4°C，5000rpm离心5min，收集细菌沉淀，用PBS重悬洗涤2次，加入40 μ I的I X SDS上样缓冲液，煮沸7min，冰浴2min，12000rpm离心5分钟，同时设立带pET_32a质粒的BL21大肠杆菌对照；
[0021 ] 同时，将剩余的40ml菌液用PBS洗2次，加ImL裂解缓冲液、10 μ I溶菌酶，将40ml菌液浓缩至4ml，超声波裂解浓缩菌液后12000rpm离心lmin，沉淀用PBS重悬加入40 μ I的I X SDS上样缓冲液，上清加入等量的2 X SDS上样缓冲液，煮沸5min，冰浴2min，_20°C备 用。
[0022]作为优选，超声波裂解浓缩菌液的条件为200?，处理4s，间隔4s，共99次。
[0023]作为优选，RT-PCR扩增的反应体系为:10XPCR buffer5 μ I, IOmM dNTPs4 μ I,ANCE-Upl μ 1，ANCE-Downl μ 1，cDNA2 μ 1，ddH2036.5μ l,5U/y I Taq 酶 0.5 μ 1，总体积 50.0 μ I ;扩增程序:94 0C 5min — 94 °C 30sec, 55 °C 30sec, 72 °C lmin, 30 个循环—72°C IOmin。
[0024]本发明对简单异尖线虫的Ani s4抗原基因进行了克隆和表达。根据已报道的简单异尖线虫的Ani s4抗原基因序列设计引物，以简单异尖线虫第三期幼虫总RNA为模板，用RT-PCR的方法扩增得到500bp大小的特异片段，将扩增产物克隆至PMD18-T转化感受态菌DH5-a，经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列比较，同源性为97.8%。然后将重组质粒和表达载体pET-32a分别以BamH I和Hindm双酶切后构建重组表达载体pET-32a-An1-s4，并将其转化入大肠杆菌BL21中，提取质粒经酶切和PCR鉴定正确后，用IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测显示，融合蛋白的分子量约为25kDa，Ani s4基因在大肠杆菌中成功表达。同时所构建的表达蛋白具有的His-tag为其后的纯化工作提供了极大的便利。该ES抗原蛋白的成功表达，为后续的简单异尖线虫免疫学检测方法的研究奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1是Ani s4基因的RT-PCR扩增图，其中M.DNA Marker ;1.阴性对照；2.RT-PCR扩增产物；
[0026]图2是pl8-T-An1-s4PCR及双酶切鉴定，其中M.DNA Marker ；1.阴性对照；2.重组质粒PCR鉴定；3.双酶切产物；
[0027]图3是pl8-T-Ani_s4序列比对结果；
[0028]图4是pET32a-Ani_s4重组质粒PCR及双酶切鉴定图，其中MDNA Marker; 1.阴性对照；2.DH5- α重组质粒PCR扩增产物；3.BL21重组质粒PCR扩增产物；
4.pET32a-An1-s4BamH I 和 HindIII 双酶切产物；
[0029]图5是pET32a-Ani_s4与公布序列比较图；
[0030]图6是pET32a-Ani_s4与公布序列的有效作用蛋白氨基酸序列比较图谱；
[0031]图7 是本发明 SDS-PAGE 图，其中 M.Protein Molecular weight Marker ；1.pET-32a 空载体 BL21 诱导 8 小时；2.pET32a_Ani_s4BL21 未诱导；3_6.pET32a_Ani_s4 分别诱导2，4，6，8小时的表达产物；
[0032]图8 是本发明 Western-blot 图，其中 M.预染蛋白 Marker; 1.pET32a-Ani_s4BL21诱导8小时的表达产物。 【具体实施方式】
[0033]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0034]在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0035]实施例
[0036]一、方法
[0037]线虫虫种简单异尖线虫虫种由舟山出入境检验检疫局提供。
[0038]质粒和细菌pMD18-T载体为TaKaRa有限公司产品，pET_32a质粒、E.coli DH5 α、E.coli BL21由本实验室保存。
[0039]工具酶T4DNA连接酶、限制性内切酶BamH I,HindIH和Taq DNA聚合酶为TaKaRa有限公司产品，cDNA合成试剂盒为申能博彩公司产品，DNA片段纯化回收试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。
[0040]抗体鼠Ant1-His抗体、羊抗鼠IgG-HRP均为Novagen公司产品。
[0041]其他试剂dNTP、DL2000DNA Marker、小分子量蛋白质Marker为TaKaRa公司产品，Trizol 试剂为上海生工产品，Prestained Protein Molecular Weight Marker 为Fermentas公司产品。LB培养基、SDS-PGAE和Western-blot所用溶液配制参照《分子克隆实验指南(第三版)》，具体参照附录。纯化蛋白用的镍琼脂糖凝胶FF购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司，缓冲液等配制参照附录。
[0042]主要仪器生化培养箱、高速台式冷冻离心机、-70°C超低温冰箱、PCR仪、核酸电泳仪、紫外分光光度计、PH计、电子天平、凝胶自动成像系统、Mi 11 ipore超滤纯水系统等。
[0043]1、简单异尖线虫总RNA的提取
[0044]参照Trizol Reagent Total RNA Isolation Kit说明书进行操作，提取简单异尖线虫的总RNA。步骤如下:[0045](I)取适量纯化简单异尖线虫m期幼虫经DEPC处理水离心洗涤后转入玻璃研磨器中，不断研磨，使虫体充分破碎，转入1.5mL EP离心管中，加入ImL Trizol试剂(_20°C下预冷)，冰浴研磨lOmin，然后倒入DEPC预处理的1.5mL EP离心管中，颠倒混匀15s，室温放置5min,使核蛋白分解完全；
[0046](2)加氯仿1/5体积(0.2mL),用力颠倒混匀15s,室温静置5min ；
[0047](3)4°C，12000rpm离心15min，转上层水相(约400 μ I)于另一支1.5mL EP离心管管中，加等体积(0.5mL)异丙醇，混匀，_20°C静置20min ；
[0048](4)4°C，12000rpm 离心 lOmin，弃上清，沉淀为 RNA,加 _20°C预冷用 DEPC 水配 75%乙醇ImL洗涤RNA ；
[0049](5) 4°C, 12000rpm离心5min,弃上清，室温下使乙醇挥发完全；
[0050](6)加20 μ I DEPC水溶解RNA，_20°C加入70%乙醇保存。
[0051]2、简单异尖线虫Ani s4抗原基因的RT-PCR扩增
[0052]①引物设计
[0053]扩增的简单异尖线虫抗原基因按照Rodriguez-Mahillo等(Ana
1.Rodriguez-MahiIlo，Miguel Gonzalez-Munj Fernando Gomez-Aguado，etal.Cloning and characterisation of the Anisakis simplex allergen Ani s4asa cysteine-protease inhibitor.1nternational Journal for Parasitology.2007,37:907-917.)发表的序列。根据其阅读框的序列特点，在序列的两端分别加上BamH I和HindIH酶切位点设计引物，同时增加保护性碱基:
[0054]上游引物(ANCE-Up):5’一CGGGATCCATGCAATCCAGAATCGTCGT— 3’ (SEQ ID N0.1),
[0055]下游引物(ANCE-Down):5，一CCCAAGCTTGCAAACAAGCCAGTGTCATA—3，(SEQ IDN0.2)，
[0056]引物退火温度为55°C，预期扩增片段为510bp。
[0057]引物由上海英骏生物技术有限公司合成，用ddH20溶解配成20 μ M的浓度。
[0058]②简单异尖线虫cDNA的合成
[0059]按照cDNA合成试剂盒说明书进行简单异尖线虫cDNA的合成。取一 0.5mL PCR管，按20 μ I体系调制反应液:
[0060]
【权利要求】
1.一种简单异尖线虫Ani S 4抗原基因的克隆和表达方法，其特征在于包括如下步骤: ①简单异尖线虫总RNA的提取， ②简单异尖线虫Anis 4抗原基因的RT-PCR扩增， 根据Ani s 4抗原基因其阅读框的序列特点，在序列的两端分别加上及和历Π1酶切位点设计引物，同时增加保护性碱基；设计的引物如下:
上游引物 5’一CGGGATCCATGCAATCCAGAATCGTCGT — 3’ (SEQ ID N0.1), 下游引物 5’一CCCAAGCTTGCAAACAAGCCAGTGTCATA — 3’ (SEQ ID N0.2), 以步骤①提取的总RNA为模板，反转录出单链cDNA，经PCR扩增，获得目的基因Ani s4, ③将纯化后的目的基因PCR产物 和pMD18-T载体进行连接，获得重组质粒pMD18-T-Ani_s4 ； ④原核表达载体的构建和鉴定: BamHl取Hind似双酶切质粒pMD18-T-Ani_s4和质粒pET_32a，回收所需目的片段，加入T4 DNA连接酶进行连接；将连接产物转化感受态细胞，抽提质粒；再应用质粒转化大肠杆菌，BamH I細ind /Z/双酶切筛选阳性克隆，命名为pET32a-Ani_s4 ； ⑤IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白， 含重组表达质粒的菌种活化后，将阳性菌接种到含Amp的LB液体培养基中，37 V振荡培养至菌液的OD值为0.5-0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为I mmol/L后34 °C继续振荡培养进行诱导表达； 诱导表达后通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达。
2.根据权利要求1所述的简单异尖线虫Anis 4抗原基因的克隆和表达方法，其特征在于IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白的具体步骤如下: 含重组表达质粒的菌种活化后，取Iml阳性菌接种到50mL含Amp的LB液体培养基中，于37 °C摇床中以195rpm振摇培养，至菌液的OD值约为0.5-0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为I mmol/L后34 °C继续振荡培养，分别在诱导前(Oh)和诱导后2、4、6、8 h吸取2mL菌样于4°C，5000 rpm离心5 min,收集细菌沉淀，用PBS重悬洗涤2次，加入40 μ I的I X SDS上样缓冲液,煮沸7 min,冰浴2 min, 12000rpm离心5分钟，同时设立带pET_32a质粒的BL21大肠杆菌对照； 同时，将剩余的40ml菌液用PBS洗2次，加I mL裂解缓冲液、10 μ I溶菌酶，将40ml菌液浓缩至4ml，超声波裂解浓缩菌液后12000 rpm离心I min，沉淀用PBS重悬加入40 μ I的I XSDS上样缓冲液，上清加入等量的2XSDS上样缓冲液，煮沸5 min，冰浴2 min,-20°C备用。
3.根据权利要求2所述的简单异尖线虫Anis 4抗原基因的克隆和表达方法，其特征在于:超声波裂解浓缩菌液的条件为200 W，处理4 S，间隔4 S，共99次。
4.根据权利要求1或2或3所述的简单异尖线虫Anis 4抗原基因的克隆和表达方法，其特征在于:RT_PCR扩增的反应体系为:10XPCR buffer 5 μ I, IOmM dNTPs 4μ I,ANCE-Up I μ I, ANCE-Down I μ I, cDNA 2 μ 1，ddH20 36.5 μ 1，5 U/ μ I Taq 酶 0.5 μ 1，总体积 50.0μ I ;扩增程序:94°C 5min — 94 °C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin, 30 个循环—72°C IOmin。
【文档编号】C12N15/70GK103993004SQ201410027151
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】李孝军, 王素华, 张明哲, 杜爱芳, 陈璐敏, 周圆, 洪青林, 唐行忠 申请人:舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心