革兰阴性菌实时荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种革兰阴性菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，由革兰阴性菌DNA抽提液、定量PCR反应液、标准品、阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物和革兰阴性菌荧光探针。本发明以革兰阴性菌16SrRNA基因为靶基因开发实时荧光定量PCR试剂盒，能简便、快速、通用检测所有革兰阴性菌，并能对检测结果阳性的革兰阴性菌进行准确定量，提高了革兰阴性菌鉴定检测的通用性和敏感性，可为临床所有革兰阴性菌感染的早期诊断提供依据。
【专利说明】革兰阴性菌实时荧光定量PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，涉及荧光定量PCR检测试剂盒，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测患者血液、脑脊液、胸水、腹水等样本中革兰阴性菌的诊断试剂盒。
【背景技术】
[0002]革兰阴性菌是医院感染的常见病原体，流行病学调查发现，医院感染中30%以上为革兰阴性菌感染，主要表现为呼吸机相关性肺炎和尿路感染。在重症监护病房中，高达70%的医院感染由革兰阴性菌引起。最常见的致病性革兰阴性菌为肠杆菌科细菌，但近年来多重耐药的革兰阴性菌如铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、产超广谱内酰胺酶(ESBLs)或产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌所致的感染呈逐渐升高趋势。对革兰阴性菌作出早期、准确的检测鉴定，能及时为临床医生提供可靠的病原学信息，对患者合理的抗菌治疗、减少耐药株的发生具有重要意义。目前临床诊断革兰阴性菌感染的方法包括血常规、C反应蛋白、血培养、病灶分泌物涂片及培养、病原菌抗原或抗体检测等，但存在需时长、易污染、阳性率低、特异性差、不能定量等缺点，无法满足临床早期、快速、准确诊断革兰阴性菌感染的需要。
[0003]随着分子生物学技术的迅速发展，聚合酶链反应(polymerase chainreaction, PCR)技术，特别是近几年兴起的实时荧光定量PCR技术为病原微生物的检测提供了新方向。实时荧光定量PCR技术的基本原理是利用Taq酶的5’ -3’外切酶核酸活性，在普通PCR基础上设计荧光双标记探针，两端分别标记荧光报告基团(R)和淬灭基团(Q)；探针保持完整时R基团的荧光信号被Q基团抑制，一旦探针被切断，Q基团的抑制作用消失，R基团的荧光信号就可被检测到。该技术通过对荧光信号的检测实现对PCR过程中产物量的实时监测，并可精确计算初始模板量，除具有定量准确、检测快速等优点外，最大的优势是采用完全闭管检测，省去了对PCR产物的后处理，避免了交叉污染。
[0004]细菌16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，该基因具有两大特点:⑴多拷贝:16S rRNA基因以3 — 7个拷贝的多拷贝形式存在于所有细菌染色体基因组中，使得对该基因的检测具有较高的敏感性#)多信息:16S rRNA基因由可变区和保守区组成，保守区为所有细菌共有，可变区可用于不同细菌的分型。目前几乎所有病原菌的16S rRNA基因测序已经完成，选择16S rRNA基因作为细菌基因分类的靶序列正逐渐成为细菌鉴别、分类的金标准。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种革兰阴性菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，由革兰阴性菌DNA抽提液、定量PCR反应液、标准品、阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成，其中定量PCR反应液含有PCR 缓冲液、MgCl2, dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物和革兰阴性菌荧光探针。
[0006]PCR扩增弓丨物序列为:[0007]上游扩增引物(SEQID No:1):5’ -CAACGCGAAGAACCTTACC-3’ ；
[0008]下游扩增引物(SEQID No:2):5’ -ACGTCATCCCCACCTTCC-3’。
[0009]突光探针和突光标记物为:
[0010]革兰阴性菌荧光探针(SEQID No:3):5’-FAM-ACATTTCACMCACGAGCTGAC-BHQ-l-3’。
[0011]标准品序列为(SEQID No:4):CAACGCGAAG AACCTTACCT GGTCTTGACA TCCACAGAACTTTCCAGAGA TGGATTGGTG CCTTCGGGAA CTGTGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTTGTGAAATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT ATCCTTTGTT GCCAGCGGTC CGGCCGGGAACTCAAAGGAG ACTGCCA GTG ATAAACTGGA GGAAGGTGGG GATGACGT。
[0012]革兰阴性菌DNA抽提液含有10mmol/L Tr1-HCl、5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(pH7.6)和0.5%十二烷基硫酸钠。
[0013]阳性对照品为大肠埃希菌灭活DNA样品，阴性对照品为无菌注射用水样品。
[0014]本发明试剂盒应保存于-20°C，尽量减少反复冻融。
[0015]本发明试剂盒使用方法:
[0016]每次检测均应设立阳性对照和阴性对照，标准品用无菌去离子水稀释为IXlO2 -1X IO9 拷贝 /ml。
[0017]革兰阴性菌DNA的提取:采集新鲜全血Iml置枸橼酸钠抗凝的无菌真空采血管中，混匀后取全血50 μ I加等量DNA抽提液置100°C煮沸10分钟，12000转/分离心5分钟，取
5μ I上清作为PCR模板。细菌培养液、脑脊液、胸水、腹水等样本中革兰阴性菌DNA的提取方法同上。
[0018]PCR扩增检测:在荧光定量PCR仪上进行，每个PCR反应体系总体积为50μ 1，其中包括45 μ I PCR反应液和5μ I模板(提取的革兰阴性菌DNA、标准品、阳性或阴性对照)。PCR反应条件:94°C 5分钟预变性，94°C 20秒一60°C 60秒，共40个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。
[0019]荧光定量结果报告:①检测样品的扩增曲线无对数增长期或CT (thresholdcycle，每个反应管内的荧光信号达到设定域值所需的循环数)值> 40为革兰阴性菌阴性；②检测样品CT值< 35且扩增曲线有明显对数增长期为革兰阴性菌阳性；③检测样品35< CT值< 40，需对样品重新进行DNA提取和PCR检测。根据标准曲线，计算各样品中的革兰阴性菌数量(拷贝/ml)。
[0020]本发明以革兰阴性菌16S rRNA基因为靶基因开发的实时荧光定量PCR试剂盒，能简便、快速、通用检测所有革兰阴性菌，并能对检测结果阳性的革兰阴性菌进行准确定量，提高了革兰阴性菌鉴定检测的通用性和敏感性，可为临床所有革兰阴性菌感染的早期诊断提供依据。本发明以革兰阴性菌16S rRNA基因中的共同保守序列设计PCR扩增引物和荧光探针，开发了能用于所有革兰阴性菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒不仅能针对性地检测所有的革兰阴性菌，而且能对感染的革兰阴性菌进行准确定量，具有简便、快捷、高效等特点，适用于临床所有革兰阴性菌感染的早期、快速诊断。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为本发明试剂盒的结构示意图。
[0022]图2为标准菌株大肠埃希菌片段序列。【具体实施方式】
[0023]本发明结合实施例和附图作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的范围。
[0024]实施例1
[0025]参见图1，本发明提供的革兰阴性菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，由革兰阴性菌DNA抽提液1、定量PCR反应液2、标准品3、阳性对照品4、阴性对照品5、说明书6和盒体7组成，定量PCR反应液单管分装，矩阵排列。
[0026]其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物和革兰阴性菌荧光探针。革兰阴性菌DNA抽提液含有lOmmol/L Tr1-HCl,5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(pH7.6)和0.5%十二烷基硫酸钠。
[0027]PCR扩增弓丨物序列为:
[0028]上游扩增引物:5’-CAACGCGAAGAACCTTACC-3’ ；
[0029]下游扩增引物:5’ -ACGTCATCCCCACCTTCC-3 ’。
[0030]突光探针和突光标记物为:
[0031 ]革兰阴性菌荧光探针:5，-FAM-ACATTTCACAACACGAGCTGAC-BHQ-1-3，。
[0032]标准品序列为:CAACGCGAAGAACCTTACCT GGTCTTGACA TCCACAGAAC TTTCCAGAGATGGATTGGTG CCTTCGGGAA CTGTGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTT GTGAAATGTTGGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT ATCCTTTGTT GCCAGCGGTC CGGCCGGGAA CTCAAAGGAGACTGCCAGTG ATAAACTGGA GGAAGGTGGG GATGACGT。
[0033]革兰阴性菌DNA抽提液含有10mmol/L Tr1-HCl、5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(pH7.6)和0.5%十二烷基硫酸钠。
[0034]阳性对照品为大肠埃希菌灭活DNA样品，阴性对照品为无菌注射用水样品。
[0035]实施例2革兰阴性菌实时荧光定量PCR检测试剂盒检测临床常见革兰阴性菌分离培养株
[0036](一)材料:
[0037]选择病原微生物包括:实验组:临床引起败血症和化脓性脑膜炎的常见革兰阴性菌17个菌属25个菌株；对照组:临床引起败血症和化脓性脑膜炎的常见革兰阳性菌5个菌属25个菌株、人巨细胞病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、新型隐球菌、白色念珠菌和人类基因组DNA。以上材料均由浙江大学医学院附属儿童医院细菌室和感染实验室提供。
[0038](二)引物及探针的设计与合成:
[0039]从GenBank中筛选不同革兰阴性菌的16S rRNA基因序列，应用MegAlign软件分析这些序列，寻找不同革兰阴性菌种属间的保守片段，分析生物进化树的规律，在革兰阴性菌保守区域筛选通用引物和通用探针，委托上海生工生物有限公司合成。
[0040]上游扩增引物序列为:5，-CAACGCGAAGAACCTTACC-3’；
[0041]下游扩增引物序列为:5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’ ；
[0042]革兰阳性菌荧光探针序列为:5’-FAM-ACATTTCACAACACGAGCTGAC-BHQ-1-3’。
[0043](三)检测标准品的制备:
[0044]用上述引物扩增标准菌株大肠埃希菌，PCR产物长度为228bp。PCR产物经鉴定和纯化后用克隆系统插入PGEM-T-Easy克隆载体，抽提重组克隆质粒，用载体引物M13R对重组的阳性克隆进行测序验证、测定浓度并换算成拷贝数/体积。
[0045]结果:经测序，上述设计标准品完全与预期相符，标准品片段序列为大肠埃希菌，参见图2。
[0046](四)临床常见革兰阴性菌分离培养株的实时荧光定量PCR检测:
[0047]对实验组25株革兰阴性菌临床分离培养株进行单管实时荧光定量PCR检测，结果均为阳性，CT值在16 - 25之间(参见表1);对照组25株革兰阳性菌临床分离培养株、人巨细胞病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、新型隐球菌、白色念珠菌和人类基因组DNA检测结果均为阴性(参见表2)。
[0048]表1革兰阴性菌实时荧光定量PCR检测试剂盒检测常见革兰阴性菌结果
[0049]
【权利要求】
1.一种革兰阴性菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，由革兰阴性菌DNA抽提液(I)、定量PCR反应液(2)、标准品(3)、阳性对照品(4)、阴性对照品(5)、说明书(6)和盒体(7)组成，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物和革兰阴性菌荧光探针； 上游扩增引物:5’ -CAACGCGAAGAACCTTACC-3’， 下游扩增引物:5，-ACGTCATCCCCACCTTCC-3，， 革兰阴性菌荧光探针:5’ -FAM- ACATTTCACAACACGAGCTGAC-BHQ-1-3’， 标准品序列为:CAACGCGAAG AACCTTACCT GGTCTTGACA TCCACAGAAC TTTCCAGAGATGGATTGGTG CCTTCGGGAA CTGTGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTT GTGAAATGTTGGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT ATCCTTTGTT GCCAGCGGTC CGGCCGGGAA CTCAAAGGAGACTGCCAGTG ATAAACTGGA GGAAGGTGGG GATGACGT。
2.根据权利要求1所述的一种革兰阴性菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，革兰阴性菌DNA抽提液含有10mmol/L Tr1-HCl.pH 7.6的5mmol/L乙二胺四乙酸二钠和0.5%十二烷基硫酸钠。
3.根据权利要求1所述的一种革兰阴性菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，阳性对照品为大肠埃希菌灭活DNA样品，阴性对照品为无菌注射用水样品。
4.根据权利要求1所述 的一种革兰阴性菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，本发明试剂盒应保存于-20°C，减少反复冻融。
【文档编号】C12Q1/10GK103789425SQ201410027125
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】杜立中, 尚世强, 舒强, 陶然, 李伟 申请人:浙江大学