专利名称：：实时定量PCR检测花生金属硫蛋白mRNA表达水平的方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测花生金属硫蛋白mRNA表达水平的方法，尤其涉及一种实时定量PCR检测花生金属硫蛋白mRNA表达水平的方法。
背景技术：
：金属硫蛋白(metallothioneins，MTs)是一类富含Cys、通过Cys残基上的-SH与镉等重金属离子螯合形成无毒或低毒的络合物，还可以与重金属等胁迫条件诱发产生的自由基、R0S发生氧化还原反应，从而降低氧化损伤。植物金属硫蛋白基因的表达行为具有多样性和复杂性，其表达因不同物种、不同MT类型、不同组织器官、不同外界条件而表达特性各异，与植物的生长发育阶段也密切相关。实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号来实时监测产物量的变化。SYBRGreenI实时定量PCR是PCR定量技术的一种，可以对基因扩增的起始模板的拷贝数进行精确的定量，还可以通过熔解曲线判断扩增产物的特异性，是一种灵敏度高、特异性好的检测技术。花生金属硫蛋白基因已有研究表明在花生的重金属脱毒和活性氧的清除中发挥作用，但MT基因表达与其发挥作用的机理仍不清楚。我们应用SYBRGreenI实时定量PCR技术，建立检测花生金属硫蛋白mRNA表达水平的方法，对于阐明MT基因表达的作用机理具有一定指导作用。mRNA表达水平检测是从基因水平研究生理、病理反应的一项基本技术。目前最常规的方法包括Northern杂交、核糖核酸酶保护分析法等，但常规的方法均需要消耗很长时间，而且这些方法均存在一些不足。Northern印迹法，将RNA固定在硝酸纤维素膜上后，用互补的，具有放射性标记的RNA或DNA探针与其杂交。此方法需要的试剂多，RNA质量要求高，不能检测低丰度mRNA，敏感性低，而且在测量同一样品不同mRNA丰度时显得笨拙。核糖核酸酶保护分析法检测敏感性较Northern杂交高，可同时检测同一样品中不同丰度mRNA，但需要利用与靶mRNA恰好互补的反义核酸探针，这样如果实验产生易于被核糖核酸酶切割的RNA-RNA杂交时，将出现问题。实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号来实时监测产物量的变化。主要类型有SYBR染料法、探针法和分子信号技术。综上所述，现有技术的缺点是成本高，效率底，耗时间等类似问题。目前最常规的方法包括Northern杂交、核糖核酸酶保护分析法等，但这些方法分别存在一些不足Northern印迹需要的试剂多，RNA质量高，不能检测低丰度mRNA，敏感性低而且在测量同一样品不同mRNA丰度时显得笨拙；核糖核酸酶保护分析法检测敏感性较Northern杂交高，可同时检测同一样品中不同丰度mRNA，但需要利用与靶mRNA恰好互补的反义核酸探针，这样如果实验产生易于被核糖核酸酶切割的RNA-RNA杂交时，将出现问题。
发明内容本发明本发明利用SYBRGreenI实时定量PCR检测金属硫蛋白mRNA表达水平，构建所要检测基因标准品后，可以对该基因扩增的起始模板的拷贝数进行精确的定量，还可以通过熔解曲线判断扩增产物的特异性，是一种灵敏度高、特异性好的检测技术。本发明所述的实时定量PCR检测花生金属硫蛋白mRNA表达水平的方法包括如下步骤1.通过将从花生组织中获得金属硫蛋白基因与载体连接，构建重组质粒，作为实时定量PCR的标准品；2.提取含有目的基因的重组质粒，计算出分子拷贝数，将重组质粒稀释成不同倍数，即为实时定量PCR反应的标准品模板；及3.提取所需组织的总RNA，反转录成cDNA作为实时定量PCR模板，进行实时定量PCR，得出起始模板的拷贝数，对其mRNA表达水平进行检测分析。此外，根据本发明的优选实施方式，通过RT-PCR技术获得步骤1)中所述金属硫蛋白基因，且步骤1)中通过反转录合成cDNA进行实时定量PCR反应。其中，通过反转录合成cDNA后的扩增程序如下95°C变性2分钟；95°C15秒_58°C15秒_72°C20秒本步结束时进行荧光信号收集40个循环；通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，然后在紫外灯下切下目的基因条带，用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，即获得纯化的AhMT基因片段。根据本发明的另一个优选实施方式，步骤1)中所述载体为PMD18-T载体，其与金属硫蛋白基因片段以摩尔比13110进行连接，连接反应时间为4小时。根据本发明另外的一个优选实施方式，步骤2)中所述实时定量PCR反应的总体系为25111:上、下游引物0.5111，模板2111，2\3￥81PremixExTaq12.5yl及灭菌双蒸水，其中所述SYBRPremixExTaq含有TaqDNA聚合酶、dNTP、SYBRGreenI染料。通过紫外分光光度计测量质粒的A260的值，通过Mr和阿伏伽德罗常数计算出分子拷贝数。根据本发明的另一个优选实施方式，步骤2)中所述实时定量PCR反应的程序包括第一步预变性；第二步荧光收集，95°C15秒-58°C15秒_72°C20秒本步结束时进行荧光信号收集40个循环；第三步融解曲线分析65°C30秒逐步升至95°C，每隔0.2°C收集一次荧光。与现有技术相比，本发明步骤3中利用实时荧光定量PCR技术基因表达水平检查分析仅需1小时，且能够同时检测大量样品，方法简单容易操作，结果分析更快捷方便。附图简要说明图1.花生AhMT2a基因的扩增产物其中DNA标记物(DL2000)。图2.pMD18-T/AhMT2a重组载体的鉴定其中DNA标记物(DL2000)A:pMD18-T/AhMT2a重组载体的菌落PCR鉴定B:PMD18-AhMT2重组载体的双酶切鉴定。图3.pMD18-T/AhMT2a的扩增动力曲线(a)和回归曲线(b)。图4.pMD18-T/AhMT2a的扩增产物的熔解曲线。具体实施例方式结合上述说明书附图，将对本发明进行进一步的说明本发明涉及一种实时定量PCR检测花生金属硫蛋白mRNA表达水平的方法包括如下步骤1、检测标准品的构建应用RT-PCR技术从花生组织中获得金属硫蛋白基因(AhMT)，与pMD18_T载体连接，构建重组质粒，作为实时定量PCR的标准品。具体方法如下(1)从lOOmg花生组织中提取总RNA，通过紫外分光光度计和凝胶电泳确定RNA的纯度和浓度。采用MMLV反转录试剂盒合成cDNA进行实时定量PCR反应。扩增程序如下95°C变性2分钟；95°C15秒_58°C15秒_72°C20秒本步结束时进行荧光信号收集40个循环；通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，然后在紫外灯下切下目的基因条带，用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，即获得纯化的AhMT基因片段。(2)重组质粒的连接、转化、阳性克隆筛选及鉴定将PMD18-T载体与AhMT基因片段以适当比例(摩尔比13110)进行连接，连接反应时间为4h。连接产物转化T0P10感受态细胞，采用氨苄青霉素抗性LB琼脂糖平板初次筛选和菌落PCR再次筛选的方法确定阳性菌落，在氨苄青霉素抗性LB培养液中扩增阳性菌落，然后从菌液中提取质粒进行双酶切鉴定，最后将菌液送去测序进行再次验证。2.SYBRGreenI实时定量PCR检测方法的建立标准曲线的绘制提取含有目的基因的重组质粒，通过紫外分光光度计测量质粒的A260的值，根据Mr和阿伏伽德罗常数计算出分子拷贝数，将重组质粒稀释成不同倍数即为实时定量PCR反应的标准品模板。实时定量PCR反应的总体系为25yl上、下游引物0.5ii1，模板2ii1，2XSYBRPremixExTaq12.5ii1(含有TaqDNA聚合酶、dNTP、SYBRGreenI染料等成分)及灭菌双蒸水。反应程序如下第一步预变性95°C变性2分钟；第二步荧光收集95°C15秒-58°C15秒_72°C20秒本步结束时进行荧光信号收集40个循环；第三步融解曲线分析65°C30秒逐步升至95°C，每隔0.2°C收集一次荧光。反应后得到Cp值，利用LightCyclersoftwarei05荧光定量分析软件自动绘制动力扩增曲线和回归曲线，用熔解曲线分析实验的特异性。3.样品的检测提取所需组织的总RNA，反转录成cDNA作为实时定量PCR模板，进行实时定量PCR，方法同上。由得出Cp值从标准曲线中得出起始模板的拷贝数，对其mRNA表达水平进行检测分析。实施例1材料与方法1.1材料高积累镉花生品种XA004和低积累镉花生品种XD011，均由山东省花生研究所提供。实时荧光定量采用德国罗氏公司LightCyclerf.O实时荧光定量PCR仪，配有该公司提供的LightCyclersoftware4.05荧光定量分析软件。SYBRGreenI荧光定量试剂盒、MMLV反转录试剂盒、PCR试剂盒和pMD18-T载体连接试剂盒购于宝生物工程有限公司。植物RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于美国OMEGA生物技术公司。T0P10感受态细胞购于北京天根生物公司。PCR引物合成和质粒测序由南京金思特生物公司完成。1.2方法1.2.1营养液培养花生幼苗花生种子先经75%乙醇处理1分钟，再用0.1%的氯化汞进行消毒处理15分钟，最后用去离子水反复冲洗3-4遍备用。恒温25°C浸种12h，将吸胀后的种子，摆放于小的塑料盆中的尼龙网上，每盆20粒，用Hongland营养液在人工气候箱下培养，白天28V16小时，黑夜26°C8小时。每两天换一次营养液。营养液培养6天后，幼苗用于实验。1.2.2重组质粒pMD18_T/AhMT2a的构建应用RT-PCR技术从花生幼苗组织中获得AhMT2a基因片段，与pMD18_T载体连接，构建重组质粒pMD18-T/AhMT2a，作为实时定量PCR实验的定量模板。(l)AhMT2a基因片段的制备利用RNA提取试剂盒，从lOOmg花生幼叶中总RNA，通过紫外分光光度计测量A260/A280的比值，确定RNA的纯度和浓度。采用MMLV反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应。AhMT2a基因引物上游引物5，-GAAGGTGCTGAAATGGGTGT-3，，下游引物5，-CAATTGGATTTGCCTGAGGT-3，；扩增程序如下95°C变性2分钟；95°C15秒_58°C15秒_72°C20秒本步结束时进行荧光信号收集40个循环；扩增片段为229bp。通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，然后在紫外灯下切下目的基因条带，用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，即获得纯化的AhMT2a基因片段。(2)重组质粒的连接、转化、阳性克隆筛选及鉴定将pMDIS-T载体与AhMT2a基因片段以适当比例(摩尔比13110)进行连接，连接反应时间为4h。连接产物转化T0P10感受态细胞，采用氨苄青霉素抗性LB琼脂糖平板初次筛选和菌落PCR再次筛选的方法确定阳性菌落，在氨苄青霉素抗性LB培养液中扩增阳性菌落，然后从菌液中提取质粒进行双酶切鉴定，最后将菌液送去测序进行再次验证。1.2.3SYBRGreenI实时定量PCR检测方法的建立标准曲线绘制提取重组质粒PMD18T_AhMT2a，通过紫外分光光度计测量质粒的A260值，根据Mr和阿佛加德罗常数计算出分子拷贝数，将重组质粒(即实时定量PCR反应的标准品)稀释成1012U0nU010U09U08U07copy/mLo实时定量PCR反应的总体系为25iU，其中包括上、下游引物各0.5yl(引物序列同前)，重组质粒模板2iU，2XSYBRPremixExTaq12.5ii1(含有TaqDNA聚合酶、dNTP、SYBRGreenI染料等成分)。反应条件是95°C预变性2min后进入循环，94V变性15s，58°C退火15s，72°C延伸20s，共45个循环。荧光域值的设置为315个循环左右的荧光信号强度标准偏差的10倍。循环结束后，LightCyclersoftware4.05荧光定量分析软件自动绘制扩增动力曲线和回归曲线。实时定量PCR反应的特异性分析通过熔解曲线分析实时定量PCR反应产物的纯度以判断实验的特异性。熔解曲线测定的方法是将实时定量PCR产物从65°C缓慢而均勻地升温至95°C，温度每秒升高0.2°C读1次荧光值，由LightCyclersoftware^05荧光定量分析软件自动绘制熔解曲线。1.2.4花生幼苗AhMT2amRNA表达水平的检测培养两个不同品种花生幼苗，方法同1.2.1。观察不同品种花生幼苗不同营养器官AhMT2amRNA表达水平上的差异。按前述方法提取花生幼苗不同营养器官的总RNA，反转录得到cDNA。为了避免由于起始细胞数目不同而引起的差异，用紫外分光光度计分别测定各个营养器官提取的总RNA浓度及反转录的cDNA浓度，最后将同浓度cDNA样品作为模板进行实时定量PCR，反应条件同1.2.3，最后利用利用标准曲线计算样品中AhMT2acDNA的精确拷贝数。1.2.5统计学处理应用SPSS13.0软件，对不同营养器官的样本采用一维方差分析及多重性分析比较，对不同品种同器官的样本比较采用独立样本的秩和检验，取P<0.01为有统计学意义。2结果与分析2.1花生重组质粒pMD18_T/AhMT2a的构建从花生幼苗组织中提取总RNA进行RT-PCR，经琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增出的产物与目的片段大小一致如图1所示，该片段纯化后用于构建重组质粒pMD18-T/AhMT2a。将pMD18-T载体与AhMT2a基因片段进行连接，连接产物转化T0P10感受态细胞，采用氨苄青霉素抗性LB琼脂糖平板初次筛选阳性克隆进行菌落PCR，然后在氨苄青霉素抗性LB培养液中扩增阳性菌落，然后从菌液中提取质粒进行双酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示，PCR产物符合AhMT2a基因片段的预期大小。同时测序鉴定也说明序列完全正确，结果表明重组质粒pMD18-T/AhMT2a构建成功。2.2SYBRGreenI实时定量PCR检测方法的建立以重组质粒pMD18_T/AhMT2a进行不同浓度稀释作为模板，进行实时定量PCR反应。从扩增动力曲线和回归曲线如图3所示，可以看出荧光信号的强度和质粒的初始拷贝数有良好的线性关系，相关系数r2>0.99，线性范围从1071012。熔解曲线分析如图4所示，熔解曲线峰比较单一，没有杂峰，无非特异性信号干扰，表明实时定量PCR产物纯度较高，反应具有良好的特异性。2.3花生幼苗AhMT2amRNA表达水平的检测花生幼苗不同营养器官提取总RNA，反转录成cDNA进行实时定量PCR。实时荧光定量PCR得出的Cp值，然后利用标准曲线计算各样品中AhMT2acDNA的精确拷贝数，结果如表1所示，经统计学分析后，得出两品种不同营养器官的AhMT2amRNA表达具有显著性差异，其中根>叶>茎，且同一营养器官低积累镉花生品种XD011的AhMT2amRNA表达均显著的低于高积累镉花生品种XA004(P<0.01)。熔解曲线分析得出峰比较单一，没有杂峰，无非特异性信号干扰，故该反应具有良好的特异性，表明了结果是准确可靠的。表1.花生幼苗不同部位AhMT2a基因mRNA表达水平的差异<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求一种实时定量PCR检测花生金属硫蛋白mRNA表达水平的方法，其包括如下步骤1)通过将从花生组织中获得金属硫蛋白基因与载体连接，构建重组质粒，作为实时定量PCR的标准品；2)提取含有目的基因的重组质粒，计算出分子拷贝数，将重组质粒稀释成不同倍数，即为实时定量PCR反应的标准品模板；及3)提取所需组织的总RNA，反转录成cDNA作为实时定量PCR模板，进行实时定量PCR，得出起始模板的拷贝数，对其mRNA表达水平进行检测分析。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过RT-PCR技术获得步骤1)中所述金属硫蛋白基因。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤1)中通过反转录合成cDNA进行实时定量PCR反应。4.根据权利要求3所述的方法，其中通过反转录合成cDNA后的扩增程序如下95°C变性2分钟；95°C15秒-58°C15秒_72°C20秒，本步结束时进行荧光信号收集40个循环；通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，然后在紫外灯下切下目的基因条带，用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，即获得纯化的AhMT基因片段。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤1)中所述载体为PMD18-T载体，其与金属硫蛋白基因片段以摩尔比13110进行连接，连接反应时间为4小时。6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)中所述实时定量PCR反应的总体系为25μ1上、下游引物0.5μ1，模板2μ1，2XSYBRPremixExTaq12.5μ1及灭菌双蒸水，其中所述SYBRPremixExTaq含有TaqDNA聚合酶、dNTP、SYBRGreenI染料。7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)中通过紫外分光光度计测量质粒的A260的值，并计算出分子拷贝数。8.根据权利要求1、6或7中任一项所述的方法，其中步骤2)中所述实时定量PCR反应的程序包括第一步预变性；第二步荧光收集，95°C15秒-58°C15秒_72°C20秒，本步结束时进行荧光信号收集40个循环；第三步融解曲线分析65°C30秒逐步升至95°C，每隔0.2°C收集一次荧光。全文摘要一种实时定量PCR检测花生金属硫蛋白mRNA表达水平的方法，其包括如下步骤1)通过将从花生组织中获得金属硫蛋白基因与载体连接，构建重组质粒，作为实时定量PCR的标准品；2)提取含有目的基因的重组质粒，计算出分子拷贝数，将重组质粒稀释成不同倍数，即为实时定量PCR反应的标准品模板；及3)提取所需组织的总RNA，反转录成cDNA作为实时定量PCR模板，进行实时定量PCR，得出起始模板的拷贝数，对其mRNA表达水平进行检测分析。文档编号G01N21/64GK101818205SQ20101017313公开日2010年9月1日申请日期2010年5月5日优先权日2010年5月5日发明者万书波,单世华,张廷婷,李春娟,杨志艺,闫彩霞申请人:山东省花生研究所