人疱疹病毒6型实时荧光定量pcr分型检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒，由定量PCR反应液、HHV-6A标准品、HHV-6B标准品、HHV-6A阳性对照品、HHV-6B阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上、下游扩增引物、HHV-6A荧光探针和HHV-6B荧光探针。本发明试剂盒采用实时荧光定量PCR技术和双色荧光探针，能通过一步法检测HHV-6的两个亚型，对样品中的HHV-6A和HHV-6B能同时进行分型，对阳性的病毒亚型能实时准确定量，可满足早期、准确、分型诊断HHV-6感染的迫切需要，为HHV-6感染的流行病学调查和针对性治疗提供依据。
【专利说明】人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，涉及荧光定量PCR检测试剂盒，具体涉及一种双探针实时荧光定量PCR检测并分型患者血液、尿液、脑脊液等样本中人疱疹病毒6型(humanherpesvirus 6，HHV-6)的诊断试剂盒，能同时分型和定量的HHV-6的两个亚型HHV-6A和HHV-6B。
【背景技术】
[0002]疱疹病毒科是一群中等大小、有包膜的DNA病毒，现已发现100种以上。已知与人类疾病相关的疱疹病毒包括单纯疱疹病毒I型和2型(HSV-1、HSV-2)、水痘一带状疱疹病毒(VZV)、爱泼斯坦一马尔病毒(EBV)、人巨细胞病毒(HCMV)、人疱疹病毒6型、7型和8型(HHV-6、HHV-7、HHV-8)。其中，HHV-6属β疱疹病毒亚科，可分为6Α型和6Β型两个亚型，为较新发现的人疱疹病毒，是幼儿急疹(ES)的病原体。近年发现HHV-6还可引起儿童病毒性脑炎，并可能导致死亡和严重的神经系统后遗症。HHV-6A和HHV-6B在病毒学和流行病学上具有显著差别，在引起脑炎的致病性上也存在差异，因此在临床诊断HHV-6感染时有必要进行准确的病原学分型。当机体免疫功能低下或受抑制时，易引起HHV-6感染或激活，早期诊断和及时抗病毒治疗可明显改善预后，降低病死率。因HHV-6感染的临床表现多样，且与其他疱疹病毒相比临床症状和体征多无特异性，因此早期诊断和及时治疗需依赖实验室检测。
[0003]传统的疱疹病毒检测方法主要包括病毒分离培养和血清学检测，前者曾为疱疹病毒的诊断“金标准”，但存在需时长(3-30天)、敏感性低(尤其在抗病毒药物治疗后)、分型困难等缺陷；后者又分为抗原直接检测法和抗体间接检测法，抗原直接检测法由于某些病毒不产生可检测的抗原而导致敏感性低，抗体间接检测法由于疱疹病毒感染后需I周左右才产生有效浓度的抗体而无法进行早期诊断，且不同疱疹病毒间存在交叉反应，抗体特异性不闻。
`[0004]随着分子生物学技术的迅速发展，聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术，特别是近几年兴起的实时荧光定量PCR技术为病原微生物的检测提供了新方向。实时荧光定量PCR技术的基本原理是利用Taq酶的5’_3’外切酶核酸活性，在普通PCR基础上设计荧光双标记探针，两端分别标记荧光报告基团(R)和淬灭基团(Q);探针保持完整时R基团的荧光信号被Q基团抑制，一旦探针被切断，Q基团的抑制作用消失，R基团的荧光信号就可被检测到。该技术通过对荧光信号的检测实现对PCR过程中产物量的实时监测，并可精确计算初始模板量，除具有定量准确、检测快速等优点外，最大的优势是采用完全闭管检测，省去了对PCR产物的后处理，避免了交叉污染。
[0005]目前的实时荧光定量PCR技术随着材料和仪器的进一步发展，通过在荧光探针的5’端标记不同的荧光染料(FAM、HEX、ROX等)及多通道荧光定量PCR仪，可以实现基因分型、基因突变检测、SNP分析等研究。本发明基于上述技术背景，设计针对HHV-6A和HHV-6B的特异性探针，开发能一步法分型和定量HHV-6的荧光定量PCR检测试剂盒，旨在满足临床HHV-6感染早期、快速、分型诊断的需求，为临床HHV-6感染的流行病学调查和针对性治疗提供帮助。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒。是一种同时分型和定量HHV-6的实时荧光定量PCR检测试剂盒，由定量PCR反应液、HHV-6A标准品、HHV-6B标准品、HHV-6A阳性对照品、HHV-6B阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物、HHV-6A荧光探针和HHV-6B荧光探针。
[0007]PCR扩增弓丨物序列为:
上游扩增引物(SEQ ID No:1):5’ -CCGTGAAGTTGGGGGATGAG-3’ ；
下游扩增引物(SEQ ID No:2):5’ -CAGAAGCAGCAATCGCAACAC-3’ ；
检测各疱疫病毒的荧光探针和荧光标记物为:
HHV-6A 荧光探针(SEQ ID No:3):5’ FAM-ACAGACTCACGGATACAAG-BHQ-1-3’ ；
HHV-6B 荧光探针(SEQ ID No:4):5’ HEX-ACAGACTCGCGAACACAAG-BHQ-1-3’。
[0008]HHV-6A 标准品序列为(SEQ ID No:5):CCGTGAAGTT GGGGGATGAG ACTCATCGGTTTGTGAAGCC TTGTATCCGT GAGTCTGTGC TTGGGAGTCT ACTAAAGGAC TGGCTGGCCA AGAGACGAGAAGTGAAGGCG GAGATGCAGA AC TGTTCGGA TCCGATGATG AAACTTCTTC TGGATAAAAA GCAGCTCGCTCTGAAAACAA CATGTAACTC GGTGTACGGT GTCACGGGAG CGGCGCACGG GTTATTGCCG TGTGTTGCGATTGCTGCTTC TG0
[0009]HHV-6B 标准品序列为(SEQ ID No:6):CCGTGAAGTT GGGGGATGAG ACCCATCGGTTTGTGAAGCC TTGTGTTCGC GAGTCTGTGC TTGGAAGTCT ACTAAAGGAC TGGCTGGCCA AGAGACGAGAAGTGAAGGCG GAGATGCAAA ACTGTTCGGA TCCAATGATG AAACTCCTTC TGGATAAAAA GCAGCTCGCTCTCAAAACAA CATGTAACTC GGTGTACGGT GTCACGGGAG CGGCGCACGG GTTATTGCCG TGTGTTGCGATTGCTGCTTC TG0
[0010]HHV-6A阳性对照和HHV-6B阳性对照分别为HHV-6A和HHV-6B灭活病毒株样品，阴性对照为无菌注射用水样品。
[0011]本发明试剂盒应保存于-20°C，尽量减少反复冻融。
[0012]本发明试剂盒使用方法:
每次检测均应设立阳性对照和阴性对照，标准品用无菌去离子水稀释为IXlO4 -1X IO7拷贝。
[0013]疱疹病毒DNA的提取:严格按照商品化的QIAamp DNA抽提试剂盒操作，从临床标本或病毒分离培养物中提取疱疹病毒DNA。
[0014]PCR扩增检测:在双色(或以上)荧光定量PCR仪上进行，每个PCR反应体系总体积为25μ?,其中包括20 μ? PCR反应液和5μ1模板(提取的疱疹病毒DNA、标准品、阳性或阴性对照)。探针检测模式为:FAM、HEX通道分别用于检测HHV-6A、HHV-6B。PCR反应条件:94°C
5分钟预变性，94°C 20秒一60°C 60秒，共40个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。
[0015]荧光定量结果报告:①检测样品的扩增曲线无对数增长期或双探针CT(域值循环数，threshold cycle)值均> 40为阴性；②检测样品某一探针CT值< 38且扩增曲线有明显对数增长期，则该探针对应的HHV-6亚型为阳性；同一反应体系中两个探针CT值< 38且扩增曲线有明显对数增长期，则为HHV-6A和HHV-6B混合阳性；③检测样品某一探针38< CT值< 40，需对样品重新进行DNA提取和PCR检测。
[0016]本发明采用实时荧光定量PCR技术和双色荧光探针，开发研制了用于HHV-6分型和定量检测的试剂盒。该发明试剂盒能通过一步法检测HHV-6的两个亚型，对临床样品中的HHV-6A和HHV-6B不仅能同时进行分型，而且对阳性的病毒亚型能进行实时准确定量，可满足临床早期、准确、分型诊断HHV-6感染的迫切需要，为HHV-6感染的流行病学调查和针对性治疗提供依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本发明试剂盒的结构示意图。
[0018]图2为HHV-6A和HHV-6B浓度梯度标准品的标准曲线。
【具体实施方式】
[0019]本发明结合实施例和附图作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的范围。
[0020]实施例1
参见图1，本发明提供的人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒，由定量PCR反应液1、HHV-6A标准品2、HHV_6B标准品3、HHV_6A阳性对照品4、HHV_6B阳性对照品
5、阴性对照品6、说明书7和盒体`8组成。
[0021]其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物、HHV-6A荧光探针和HHV-6B荧光探针。
[0022]PCR扩增弓丨物序列为:
上游扩增引物(SEQ ID No:1):5’ -CCGTGAAGTTGGGGGATGAG-3’ ；
下游扩增引物(SEQ ID No:2):5’ -CAGAAGCAGCAATCGCAACAC-3’ ；
检测各疱疫病毒的荧光探针和荧光标记物为:
HHV-6A 荧光探针(SEQ ID No:3):5’ FAM-ACAGACTCACGGATACAAG-BHQ-1-3’ ；
HHV-6B 荧光探针(SEQ ID No:4):5’ HEX-ACAGACTCGCGAACACAAG-BHQ-1-3’。
[0023]HHV-6A 标准品序列为(SEQ ID No:5):CCGTGAAGTT GGGGGATGAG ACTCATCGGTTTGTGAAGCC TTGTATCCGT GAGTCTGTGC TTGGGAGTCT ACTAAAGGAC TGGCTGGCCA AGAGACGAGAAGTGAAGGCG GAGATGCAGA ACTGTTCGGA TCCGATGATG AAACTTCTTC TGGATAAAAA GCAGCTCGCTCTGAAAACAA CATGTAACTC GGTGTACGGT GTCACGGGAG CGGCGCACGG GTTATTGCCG TGTGTTGCGATTGCTGCTTC TG0
[0024]HHV-6B 标准品序列为(SEQ ID No:6):CCGTGAAGTT GGGGGATGAG ACCCATCGGTTTGTGAAGCC TTGTGTTCGC GAGTCTGTGC TTGGAAGTCT ACTAAAGGAC TGGCTGGCCA AGAGACGAGAAGTGAAGGCG GAGATGCAAA ACTGTTCGGA TCCAATGATG AAACTCCTTC TGGATAAAAA GCAGCTCGCTCTCAAAACAA CATGTAACTC GGTGTACGGT GTCACGGGAG CGGCGCACGG GTTATTGCCG TGTGTTGCGATTGCTGCTTC TG0
[0025]HHV-6A阳性对照和HHV-6B阳性对照分别为HHV-6A和HHV-6B灭活病毒株样品，阴性对照为无菌注射用水样品。
[0026]本发明试剂盒应保存于-20°C，尽量减少反复冻融。
[0027]实施例2人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒的敏感性和特异性试验
(一)材料:
选取病原微生物包括:实验组:HHV-6B (GS株)由南京医科大学微生物教研组提供，HHV-6A由浙江大学附属儿童医院从临床血标本中筛选获得；对照组:金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型肝炎病毒、新型隐球菌、白色念珠菌和人类基因组由浙江大学附属儿童医院细菌室、病毒室和基因扩增室提供。
[0028](二)引物及探针的设计与合成:
对HHV-6A和HHV-6B的保守区序列进行生物信息学分析，设计并筛选PCR扩增引物和特异性荧光探针，委托上海生工生物公司合成。
[0029]上游扩增引物I 序列为:5，-CCGTGAAGTTGGGGGATGAG-3’ ；
下游扩增引物 2 序列为:5’ -CAGAAGCAGCAATCGCAACAC-3’ ；
HHV-6A 荧光探针序列为:5’ FAM-ACAGACTCACGGATACAAG-BHQ-1-3’ ；
HHV-6B 荧光探针 序列为:5’ HEX-ACAGACTCGCGAACACAAG-BHQ-1-3’。
[0030](三)检测标准品的制备:
用上游扩增引物和下游扩增引物分别扩增HHV-6A和HHV-6B病毒株，各扩增片段纯化后插入pGEM-T-Easy克隆载体构建重组质粒，用分光光度计对各质粒进行定量，并用无菌去离子水以10倍比稀释各质粒进行荧光定量PCR敏感性试验。
[0031](四)试剂盒的敏感性和特异性试验:
采用人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒对上述常见病原微生物进行检测，实验组两种疱疹病毒检测结果均为阳性且分型符合，对照组金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型肝炎病毒、新型隐球菌、白色念珠菌和人类基因组等检测结果均为阴性，特异性为100%。构建的重组质粒标准品倍比稀释后检测敏感性可达10拷贝；用IO4UO5UO6UO7四个定量的浓度梯度标准品作标准曲线，其CT值与质粒拷贝数之间具有良好的线性关系(图2)。
[0032]本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限度的范围。
【权利要求】
1.一种人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒，由定量PCR反应液(I)、HHV-6A标准品(2 )、HHV-6B标准品(3 )、HHV-6A阳性对照品(4 )、HHV-6B阳性对照品(5 )、阴性对照品(6)、说明书(7)和盒体(8)组成；其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2,dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物、HHV-6A荧光探针和HHV-6B荧光探针； PCR扩增引物序列为: 上游扩增引物:5’ -CCGTGAAGTTGGGGGATGAG-3’ ； 下游扩增引物:5’ -CAGAAGCAGCAATCGCAACAC-3’ ； 检测各疱疫病毒的荧光探针和荧光标记物为:
HHV-6A 荧光探针:5’ FAM-ACAGACTCACGGATACAAG-BHQ-1-3’ ；
HHV-6B 荧光探针:5’ HEX-ACAGACTCGCGAACACAAG-BHQ-1-3’ ； HHV-6A 标准品序列为:CCGTGAAGTT GGGGGATGAG ACTCATCGGT TTGTGAAGCC TTGTATCCGTGAGTCTGTGC TTGGGAGTCT ACTAAAGGAC TGGCTGGCCA AGAGACGAGA AGTGAAGGCG GAGATGCAGAACTGTTCGGA TCCGATGATG AAACTTCTTC TGGATAAAAA GCAGCTCGCT CTGAAAACAA CATGTAACTCGGTGTACGGT GTCACGGGAG CGGCGCACGG GTTATTGCCG TGTGTTGCGA TTGCTGCTTC TG ； HHV-6B 标准品序列为:CCGTGAAGTT GGGGGATGAG ACCCATCGGT TTGTGAAGCC TTGTGTTCGCGAGTCTGTGC TTGGAAGTCT ACTAAAGGAC TGGCTGGCCA AGAGACGAGA AGTGAAGGCG GAGATGCAAAACTGTTCGGA TCCAATGATG AAACTCCTTC TGGATAAAAA GCAGCTCGCT CTCAAAACAA CATGTAACTCGGTGTACGGT GTCACGGGAG CGGCGCACGG GTTATTGCCG TGTGTTGCGA TTGCTGCTTC TG。`
2.根据权利要求1所述的一种人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒，其特征在于，HHV-6A阳性对照和HHV-6B阳性对照分别为HHV-6A和HHV-6B灭活病毒株样品，阴性对照为无菌注射用水样品。
3.根据权利要求1所述的一种人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒，其特征在于，本发明试剂盒保存于-20°C，减少反复冻融。
【文档编号】C12Q1/70GK103820574SQ201410027036
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】尚世强, 杜立中, 舒强, 陶然, 李伟 申请人:浙江大学