一种异尖科三种线虫多重pcr检测方法
【专利摘要】本发明涉及农业和动物检疫【技术领域】，特别涉及一种异尖科三种线虫多重PCR检测方法。本发明根据公布的对盲囊线虫，简单异尖线虫和宫脂线虫核糖体DNA的内转录区(ITS-1、5.8S、ITS-2)序列设计特异性引物，建立异尖科三种线虫的多重PCR反应，对线虫样品进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明，扩增的目的片段大小符合预期的设计，与预期扩增序列同源性分别达到96.2%、99.1%和99.9%。该多重PCR检测方法的特异性强，不能在除了检测的三种线虫之外的其他线虫DNA中扩增出条带；敏感性高，宫脂线虫能够检测到的最低浓度为500pg/μL，而对盲囊线虫和异尖线虫能够检测到的最低浓度则为50pg/μL。
【专利说明】—种异尖科三种线虫多重PCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业和动物检疫【技术领域】，特别涉及一种异尖科三种线虫多重PCR检测方法。
【背景技术】
[0002]异尖线虫病的病原的确定具有重要的公共卫生学意义，在《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》中所分类的可引起人异尖线虫病的主要有6类线虫，SP简单异尖线虫、典型异尖线虫、抹香鲸异尖、伪地新线虫、对盲囊线虫和宫脂线虫。在线虫的分类鉴定方法中，形态学鉴定是对异尖线虫进行分类鉴定的传统方法。但是由于鱼体内存在不同发育期的幼虫，其形态、结构存在很大差异，致使目前各属异尖线虫的鉴定存在很大的混乱，依据形态学鉴定，很难将异尖科的线虫和其他种类的线虫进行区分，因此该检测方法并非检测异尖线虫的理想方法，只有通过应用更快捷和特异的方法对异尖线虫的种属进行鉴定。
[0003]多重PCR是指在同一 PCR反应体系中加入两对或者两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，该技术已经被广泛应用于动物细菌性、病毒性、寄生虫性疾病等的诊断，被公认为是一种方便、快速、敏感、特异的诊断方法。相关研究表明，异尖科线虫核糖体 DNA 的内转录区(internal transcribed spacer ITS_1、5.8S、ITS-2)序列在线虫进化的过程中显示出种的特异性，在分类鉴定中发挥重要的作用。
[0004]在东海海域鱼类感染的异尖科线虫中，感染病原主要以异尖线虫、对盲囊线虫和宫脂线虫的幼虫为主，为了能够准确的鉴别异尖科线虫，该研究建立了异尖科三种线虫的多重PCR检测体系。根据对盲囊线虫、异尖线虫和宫脂线虫的核糖体DNA的内转录区设计特异性的引物，采用多重PCR的方法，对舟山地区被检鱼类的感染虫种进行鉴定，建立异尖科三种线虫的多重PCR检测方法，为鱼类感染异尖科线虫的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种特异性强、敏感性高的异尖科三种线虫多重PCR检测方法，该检测方法主要用于对盲囊线虫、简单异尖线虫、宫脂线虫的检测。
[0006]本发明还提供一种用于同时检测对盲囊线虫、简单异尖线虫、宫脂线虫的引物。
[0007]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0008]一种异尖科三种线虫多重PCR检测方法，所述方法不包括疾病诊断方法，其特征在于包括如下步骤:
[0009]①对盲囊线虫、简单异尖线虫、宫脂线虫的虫体DNA提取；
[0010]②引物设计与筛选:设计的引物序列为:
[0011]对盲囊线虫的特异性引物:
[0012]上游引物Contra F:5-GGATATGCGGGCGTGTTGAT-3 (SEQ ID N0.1),[0013]下游引物Contra R:5-CGTTCAAACCAGACAAGGAGC-3 (SEQ ID N0.2),
[0014]异尖线虫的特异性引物:
[0015]上游引物Anisk F:5-CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT_3 (SEQ ID N0.3),
[0016]下游引物Anisk R:5-CCCTACGAAATGGCATACTTG-3 (SEQ ID N0.4),
[0017]宫脂线虫的特异性引物:
[0018]上游引物Hystero F:5-GGGGCATAGGTGACATACTGG_3 (SEQ ID N0.5),
[0019]下游引物Hystero R:5-ACCACCAGCAGCACATCACC_3 (SEQ ID N0.6),
[0020]③对步骤②所设计的引物进行PCR反应条件优化，得到最佳多重PCR模式；
[0021]④按照步骤③的最佳PCR反应条件进行单重PCR扩增特异性验证；
[0022]⑤按照步骤③的最佳PCR反应条件进行多重PCR扩增特异性验证；
[0023]⑥按照步骤③的最佳PCR反应条件进行PCR敏感性验证。
[0024]作为优选，步骤①中虫体DNA提取方法为:将鱼体中采集的线虫样本用蒸馏水洗净后，应用DNA试剂盒进行DNA的提取，将提取的线虫的DNA置_20°C保存备用。
[0025]作为优选，步 骤③中，所述的PCR反应条件优化具体方法为:选择25 μ I的PCR反应体系，体系包含 5U/μ I 的 Taq聚合酶0.5 μ 1、10XPCR Buffer2.5 μ IUOmM dNTPl.6μ 1、模板DNA2y 1、工作浓度为20μΜ的引物0.4μ I ;退火温度根据引物Tm值范围进行51°C、52 °C、53 °C、54°C、55 °C、56 °C、57 °C、58 °C退火温度梯度试验，根据实际PCR反应结果，确定最佳的退火温度；引物浓度的调整:初次三种线虫采用相同的引物浓度，根据反应的结果，进行各引物浓度的调整，确定最佳的浓度。
[0026]作为优选，步骤③中，所述的最佳多重PCR反应条件为:25μ I的PCR反应体系，体系包含 5υ/μ I 的 Taq 聚合酶 0.5μ 1U0XPCR Buffer2.5 μ 1、IOmM dNTP 各 1.6μ 1、20 μ M的对盲囊线虫上下游引物各0.8 μ 1、简单异尖线虫上下游引物各0.4μ 1、宫脂线虫上下游引物各0.4 μ 1、三种线虫模板DNA2 μ 1，加蒸馏水至25 μ 1，多重PCR检测扩增程序:940C 5min — 94°C 30sec, 55.(TC 30sec, 72°C lmin, 30 个循环—72°C IOmin0
[0027]用于同时检测对盲囊线虫、简单异尖线虫、宫脂线虫的引物，其特征在于其序列为:
[0028]对盲囊线虫的特异性引物:
[0029]上游引物Contra F:5-GGATATGCGGGCGTGTTGAT-3 (SEQ ID N0.1),
[0030]下游引物Contra R:5-CGTTCAAACCAGACAAGGAGC-3 (SEQ ID N0.2),
[0031]异尖线虫的特异性引物:
[0032]上游引物Anisk F:5-CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT_3 (SEQ ID N0.3),
[0033]下游引物Anisk R:5-CCCTACGAAATGGCATACTTG_3 (SEQ ID N0.4),
[0034]宫脂线虫的特异性引物:
[0035]上游引物Hystero F:5-GGGGCATAGGTGACATACTGG_3 (SEQ ID N0.5),
[0036]下游引物Hystero R:5-ACCACCAGCAGCACATCACC_3 (SEQ ID N0.6)。
[0037]与常规PCR相比，多重PCR不但保持了较高的特异性和敏感性，而且更加方便、快捷和经济，一次反应可检测多个基因。尤其是在检测病原体的多重感染、流行病学调查、病原体的分型鉴定等方面具有常规PCR无可比拟的优越性。很多单一的PCR已经被组合为多重PCR应用于实践。随着分子生物学的发展，很多病原体特异性保守基因序列已经被获得，多重PCR技术将会有更加广阔的应用前景。
[0038]引物选择方面，本实验利用所设计的三对引物建立的检测异尖科三种线虫的多重PCR方法，其中引物Contra FXontra R为对盲囊线虫特异性，引物Anis F、Anis R为异尖线虫特异性，引物Hyster F.Hyster R为宫脂线虫特异性。本方法不仅可以分别扩增对盲囊线虫、异尖线虫以及宫脂线虫的DNA片段，还可以同时扩增并区分这三种线虫的混合DNA。本实验所设计的引物不能扩增伪地线虫、秀丽线虫和附红细胞体等其他病原的DNA，具有良好的特异性，这与引物设计选择的线虫核糖体DNA内转录区序列高度保守有关。采用该检测体系，能够在鱼类混合感染异尖科线虫时，对感染的虫种能够进行特异性的鉴定，从而避免了肉眼观察判定所带来的误差。该实验方法的建立为鱼类感染异尖科线虫的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。
[0039]引物设计方面，单一 PCR只能鉴定一种虫种，但多重PCR可区别三种或者更多的不同类型的虫种。在这过程中，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。不同于单重PCR的引物设计，多重PCR对引物设计有着更高的要求。由于异尖科线虫核糖体 DNA 的内转录区(internal transcribed spacer ITS_1、5.8S、ITS-2)序列在线虫进化的过程中显示出种的特异性，该区域的序列高度保守，所以可以采用该区域的基因来进行多重PCR引物的设计。在设计的过程中，引物的(G+C)%含量组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中(G+C)%含量应尽量相似，在已知扩增片段(G+C)%含量时宜接近于待扩增片段，一般以40%~60%为佳。引物内部应避免形成明显的次级结构，尤其是发夹结构。引物3’端配对DNA聚合酶是在引物3’端添加单核苷酸，所以引物3’端5~6个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格，这样才能保证PCR有效扩增。多重PCR组合的设计:各对引物应有相同的退火温度；各产物之间片段大小应该有适当的差距，以在聚丙烯酰胺凝胶电泳上能够清晰的分开为原则；扩增片段一般在150bp以上，扩增产物长度相差最好在50bp以上，以便于琼脂糖凝胶电泳时观察分辨。引物设计完成后，最好到互联网上进行BLAST序列比对，保证引物序列和靶基因之间是高度特异的。
[0040]多重PCR的反应条件的优化要比单一的PCR复杂的多，这也是多重PCR成功的关键。先进行单一的PCR反应，分别设定各引物的最佳反应条件。通过对单一 PCR反应的条件进行摸索，然后选择公共的反应条件进行三重的摸索，不断的调整反应条件，直至所有的引物都能够在同一条件下正确扩增。在PCR反应体系中，引物用量、Mg2+浓度、Taq聚合酶用量、退火温度及循环次数等因子对扩增结果都有较大影响，PCR中各种反应成份的最佳量是PCR成功的关键。通常，多重PCR中反应成份如DNA聚合酶、dNTP等都要增加，但要适度，有时过量会抑PCR反应。另外，不同PCR反应缓冲液也会明显影响多重PCR反应。体系容量大小可与单扩增相同，如果引物量比较多，可适当地增大反应体系，如反应总体积可为20μ I或25μ I。在建立的多重PCR方法中，使用相同浓度引物时，对盲囊线虫DNA的扩增效果较差，相应提高其引物浓度后，使得扩增效果得到了改善。[0041]本实验中采用将采用试剂盒提取的线虫DNA稀释100倍后作为模板，同时保证三种线虫的DNA浓度大致相同，从而方便进行各种反应试剂及反应条件的确定。未稀释的高浓度DNA的或者10倍稀释的DNA作为模板时，随Taq DNA聚合酶、引物量的增加等其他反应条件变化时，不能形成明显的梯度差别。但采用100倍稀释DNA作为模板，不同浓度的TaqDNA聚合酶、引物的PCR扩增时根据扩增结果的明显梯度变化，可初步判定出反应的适宜条件。
[0042]本发明根据公布的对盲囊线虫，简单异尖线虫和宫脂线虫核糖体DNA的内转录区(ITS-U5.8S、ITS-2)序列设计特异性引物，建立异尖科三种线虫的多重PCR反应，对线虫样品进行PCR扩增并将产物克隆到PMD18-T载体后测序。结果表明，扩增的目的片段大小符合预期的设计，与预期扩增序列同源性分别达到96.2%,99.1%和99.9%。该多重PCR检测方法的特异性强，不能在除了检测的三种线虫之外的其他线虫DNA中扩增出条带；敏感性高，宫脂线虫能够检测到的最低浓度为500pg/μ L，而对盲囊线虫和异尖线虫能够检测到的最低浓度则为50pg/yL。该检测体系的成功构建为鱼类感染异尖科线虫的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1是对盲囊线虫PCR图，其中M:DL2000DNA Marker ；1:阴性对照；2:对盲囊线虫DNA ；3:异尖线虫DNA ；4:宫脂线虫DNA ；
[0044]图2是异尖线虫PCR图，其中M:DL2000DNA Marker ；1:阴性对照；2:异尖线虫DNA ；3:对盲囊线虫DNA ；4:宫脂线虫DNA ；
[0045]图3是宫脂线虫PCR图，其中M:DL2000DNA Marker ; 1:阴性对照；2:宫脂线虫DNA ；3:对盲囊线虫DNA ；4:异尖线虫DNA ；
[0046]图4是对盲囊线虫重组质粒PCR及酶切图，其中M:1OObp DNA Marker ；1:阴性对照；2:重组质粒PCR结果；3:酶切鉴定结果；
[0047]图5是异尖线虫 重组质粒PCR及酶切图，其中M:1OObp DNA Marker ； I:阴性对照；2:重组质粒PCR结果；3:酶切鉴定结果；
[0048]图6是宫脂线虫重组质粒PCR及酶切图，其中M:1OObp DNA Marker ； I:阴性对照；
2:重组质粒PCR结果；3:酶切鉴定结果；
[0049]图7是对盲囊线虫测序比对图；
[0050]图8是异尖线虫测序比对图；
[0051]图9是宫脂线虫测序比对图；
[0052]图10是多重PCR图，其中M:100bp DNA Marker ；1:阴性对照；2:三种线虫混合DNA ；3:异尖线虫和对盲囊线虫DNA ；4:对盲囊线虫和宫脂线虫DNA ；5:异尖线虫和宫脂线虫DNA ；6:秀丽线虫DNA ；7:伪地线虫DNA ；
[0053]图11是特异性实验图，其中M:100bp DNA Marker ；1:阴性对照；2:对盲囊线虫DNA ；3:异尖线虫DNA ；4:宫脂线虫DNA ；5:伪地线虫DNA ；6:秀丽线虫DNA ；7:附红细胞体DNA ；
[0054]图12是敏感性试验图，其中M:DL2000DNA Marker ；1:阴性对照；2:50ng/y L混合线虫 DNA ；3:5ng/y L 线虫 DNA ；4:500pg/μ L 线虫 DNA ；5:50pg/μ L 线虫 DNA ；6:5pg/y L线虫 DNA ；7:0.5pg/ μ L 线虫 DNA ；8:0.05pg/ μ L 线虫 DNA。
【具体实施方式】
[0055]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0056]在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0057]实施例:
[0058]虫体来源对盲囊线虫、简单异尖线虫、宫脂线虫样本由舟山出入境检验检疫局提供。伪地新线虫DNA样本由华南农业大学朱兴全教授惠赠，秀丽线虫DNA样本由本实验室保存。
[0059]主要试剂Takara universal Genomic DNA Extraction kit、10XPCR Buffer>dNTP,Taq聚合酶和限制性内切酶BamH I和HindHI试剂、T4DNA连接酶、pMD18_T载体均购自Takara公司；、DNA片断回收试剂盒为上海生工公司产品。DNA片断回收试剂盒为东盛公司产品。
[0060]主要仪器生化培养箱、高速台式冷冻离心机、_70°C超低温冰箱、PCR仪、PH计、电子天平、凝胶自动成像系统、Millipore超滤纯水系统等。
[0061]1、线虫基因组DNA的提取
[0062]将鱼体中米集的多种线虫样本用蒸懼水洗净后，应用Takara universal GenomicDNA Extraction kit试剂盒进行DNA的提取:
[0063](I)取1-1OOmg动物组织移入冰浴预冷的Collection tube中，用研磨棒磨成糊状。
[0064](2)加入350 μ I的Solution A和0.9 μ I的RNase Al后用研磨棒快速研磨成匀浆。
[0065](3)加入350 μ I的Solution A讲研磨棒上的匀楽7中入Collection tube中，充分震荡混合后，65°C保温5分钟。
[0066](4)加入 400 μ I 的 Solution B，振荡均匀。
[0067](5)加入1ml的4°C预冷的Solution C,充分混匀后，12000rpm离心2分钟。
[0068](6)弃去上层有机相，再加入1ml的4°C预冷的Solution C，充分混匀后，12000rpm离心2分钟。
[0069](7)弃去上层有机相，然后讲水相溶液(无色下层)转移到置于Collection tube上的Filter Cap中，12000rpm离心I分钟。
[0070](8)弃去Fliter Cap,在滤液中加入400μ1的DB Buffer,混合均匀。
[0071](9)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection tube上,将上述操作8混合溶液转移至Spin Column中，12000rpm离心I分钟,弃滤液。
[0072](10)将 500 μ I 的 Rinse A 加入至 Spin Column, 12000rpm 离心 30 秒，弃滤液。
[0073](11)将 700 μ I 的 Rinse B 加入至 Spin Column, 12000rpm 离心 30 秒，弃滤液。 [0074](12)重复操作 11。
[0075](13)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管中，在Spin Column膜的中央处加入50-200 μ I的灭菌蒸懼水或Elution Buffer,室温静置I分钟。
[0076](14) 12000rpm 离心 I 分钟洗脱 DNA。
[0077]将提取的不同线虫的DNA电泳观察抽提效果，置_20°C保存备用。[0078]2、rDNA序列分析及引物设计
[0079]参考Genbank上公布的对盲囊线虫、异尖线虫和宫脂线虫的核糖体DNA内转录区(18S rRNA, ITS-1, 5.8S rRNA, ITS-2, 28S rRNA)序列，应用 MegAlign 软件将几种线虫的序列进行比对，分析内转录区序列中的各种线虫相互之间的相同区域和不同区域，从而进行特异性引物的设计。
[0080]在多重PCR引物设计中除了按常规PCR引物设计通用准则外，要求引物与靶基因具有高度的特异性，引物之间彼此无同源性，不会出现交叉错配、引物二聚体等。设计的扩增片段一般在150bp以上，不同扩增产物长度差最好在50bp以上。同时，设计的三对引物退火温度都要相近。所设计的引物如下:
[0081]对盲囊线虫:
[0082]上游引物Contra F:5-GGATATGCGGGCGTGTTGAT-3 (SEQ ID N0.1),
[0083]下游引物Contra R:5-CGTTCAAACCAGACAAGGAGC-3 (SEQ ID N0.2),
[0084]退火温度为55.1°C，预期扩增片段长度为293bp。
[0085]异尖线虫:
[0086]上游引物Anisk F:5-CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT_3 (SEQ ID N0.3),
[0087]下游引物Anisk R:5-CCCTACGAAATGGCATACTTG_3 (SEQ ID N0.4),
[0088]退火温度为53.6°C，预期扩增片段长度为562bp。
[0089]宫脂线虫:
[0090]上游引物Hystero F:5-GGGGCATAGGTGACATACTGG_3 (SEQ ID N0.5),
[0091]下游引物Hystero R:5-ACCACCAGCAGCACATCACC_3 (SEQ ID N0.6),
[0092]退火温度为55.6°C，预期扩增片段长度为795bp。
[0093]3、单重PCR反应
[0094]应用设计的三种线虫的检测引物分别进行单重PCR反应，PCR反应体系中各试剂加入量如下:
[0095]
【权利要求】
1.一种异尖科三种线虫多重PCR检测方法，所述方法不包括疾病诊断方法，其特征在于包括如下步骤: ①对盲囊线虫、简单异尖线虫、宫脂线虫的虫体DNA提取； ②引物设计与筛选:设计的引物序列为: 对盲囊线虫的特异性引物:
上游引物 Contra F: 5-GGATATGCGGGCGTGTTGAT-3 (SEQ ID N0.1),
下游引物 Contra R: 5-CGTTCAAACCAGACAAGGAGC-3 (SEQ ID N0.2), 异尖线虫的特异性引物:
上游引物 Anisk F:5- CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT-3 (SEQ ID N0.3),
下游引物 Anisk R:5- CCCTACGAAATGGCATACTTG-3 (SEQ ID N0.4), 宫脂线虫的特异性引物:
上游引物 Hystero F:5_ GGGGCATAGGTGACATACTGG-3 (SEQ ID N0.5),
下游引物 Hystero R:5_ ACCACCAGCAGCACATCACC-3 (SEQ ID N0.6), ③对步骤②所设计的引物进行PCR反应条件优化，得到最佳多重PCR模式； ④按照步骤③的最佳PCR反应条件进行单重PCR扩增特异性验证； ⑤按照步骤③的最佳PCR反应条件进行多重PCR扩增特异性验证； ⑥按照步骤③的最佳PCR反应条件进行PCR敏感性验证。
2.根据权利要求1所述的异尖科三种线虫多重PCR检测方法，其特征在于:步骤①中虫体DNA提取方法为:将鱼体中采集的线虫样本用蒸馏水洗净后，应用DNA试剂盒进行DNA的提取，将提取的线虫的DNA置_20°C保存备用。
3.根据权利要求1所述的异尖科三种线虫多重PCR检测方法，其特征在于:步骤③中，所述的PCR反应条件优化具体方法为:选择25μ I的PCR反应体系，体系包含5υ/μ I的Taq 聚合酶 0.5μ 1U0XPCR Buffer 2.5 μ IUOmM dNTP 1.6 μ 1、模板 DNA 2 μ 1、工作浓度为20 μ M的引物0.4 μ I ;退火温度根据引物Tm值范围进行51 °C、52 °C、53 °C、54°C、55 °C、56°C、57°C、58°C退火温度梯度试验，根据实际PCR反应结果，确定最佳的退火温度；引物浓度的调整:初次三种线虫采用相同的引物浓度，根据反应的结果，进行各引物浓度的调整，确定最佳的浓度。
4.根据权利要求1所述的异尖科三种线虫多重PCR检测方法，其特征在于:步骤③中，所述的最佳多重PCR反应条件为:25μ I的PCR反应体系，体系包含5U/μ I的Taq聚合酶0.5μ 1U0XPCR Buffer 2.5 μ IUOmM dNTP 各 1.6 μ 1、20 μ M 的对盲囊线虫上下游引物各0.8 μ 1、简单异尖线虫上下游引物各0.4μ 1、宫脂线虫上下游引物各0.4μ 1、三种线虫模板DNA 2 μ 1，加蒸馏水至25 μ 1，多重PCR检测扩增程序:94°C 5min —94°C 30sec,55.0°C30sec,72°C lmin，30 个循环—72°C IOmin0
5.用于同时检测对盲囊线虫、简单异尖线虫、宫脂线虫的引物，其特征在于其序列为: 对盲囊线虫的特异性引物:
上游引物 Contra F: 5-GGATATGCGGGCGTGTTGAT-3 (SEQ ID N0.1),
下游引物 Contra R: 5-CGTTCAAACCAGACAAGGAGC-3 (SEQ ID N0.2), 异尖线虫的特异性引物:
上游引物 Anisk F:5- CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT-3 (SEQ ID N0.3),下游引物 Anisk R:5- CCCTACGAAATGGCATACTTG-3 (SEQ ID N0.4),宫脂线虫的特异性引物:上游引物 Hystero F:5_ GGGGCATAGGTGACATACTGG-3 (SEQ ID N0.5),下游引物 Hystero R:5_ ACCACCAGCAGCACATCACC-3 (SEQ ID N0.6)。
【文档编号】C12Q1/68GK103993067SQ201410026824
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】李孝军, 周圆, 陈璐敏, 王素华, 杜爱芳, 洪青林, 唐行忠 申请人:舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心