一种CYP2C19*17基因多态性SNaPshot检测方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因多态性检测领域，具体涉及一种CYP2C19*17基因多态性 SNaPshot检测方法与应用。
【背景技术】
[0002] 肝脏是人体重要的解毒器官，许多药物都经肝脏代谢，细胞色素 P450 (cytochrome P450 )是主要的肝细胞I相代谢酶之一。在CYP2C亚家族中，CYP2C19亚型 对药物反应起着关键性的作用，因为它们的活性存在显著的个体差异，表现为遗传多态性， 从而产生血药浓度的个体差异。CYP2C19酶广泛分布于肝、肾、脑、皮肤、肺、胃肠道及胎盘等 组织器官，主要在肝脏。其参与多种外源性物质代谢如：药物、酒精、抗氧化剂、有机溶剂、染 料、环境污染物质等。从理论上讲，所有的药物代谢酶都具有遗传多态性。绝大多数药物代 谢酶的多态性是一种单基因多态性，是由于同一基因位点上具有多个等位基因引起的。遗 传学的改变使CYP450酶表现出遗传多态性，并且具有明显个体、种族或地域差异。
[0003] 等位基因编码的代谢酶具有不同的代谢能力：正常野生型表现为快代谢型（EM); 绝大多数突变型等位基因，因碱基的突变、插入或缺失而造成酶代谢能力降低，表现为慢代 谢型（PM)，这对治疗的个体反应和药物毒副作用都产生重要影响。
[0004] CYP2C19至少存在14种突变基因和18种等位基因突变。编码正常酶活性的基因是 CYP2C19*1，CYP2C19 等位基因主要是 *1，*2，*3......*17。而 CYP2C19*2 和 CYP2C19*3 等位 基因占东方人弱代谢表型（PM)的99%以上。*2, *3等位基因编码的酶无活性，CYP2C19*2 等位基因变异的外显子5第681位处的碱基发生变异（G/A)形成了一个异常剪接点，使得 转录时在外显子5的始端丢失了 40个碱基对（643-682bp)，从而在翻译时丢失了 215-227 位氨基酸，使215位氨基酸开头的阅读框架发生移动，因此在215位氨基酸下游第20个氨 基酸处提前产生1个终止密码，使蛋白合成过早被终止，结果使这一截短的含234个氨基酸 的蛋白质丧失了催化活性。由此导致的慢代谢在中国人中的发生率约为30%。CYP2C19*3 等位基因是在外显子4第636位发生G/A突变，产生了提前的终止密码，蛋白合成终止，使 CYP2C19酶活性丧失。通过该酶代谢的药物(如质子泵抑制剂，抗惊厥药等）随患者基因型 不同，其疗效和副作用也有明显不同。
[0005] 目前常用的对基因多态性位点检测的方法有Sanger测序及AS-PCR+琼脂糖凝胶 电泳，Sanger测序的方法检测基因多肽性位点成本相对较高，AS-PCR+琼脂糖凝胶电泳的 方法检测多态性位点灵敏性相对较低。因此需要开发一种成本相对较低，同时灵敏性好，准 确度与精密度高的基因多态性位点检测方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种CYP2C19*17基因多 态性SNaPshot检测方法与应用。
[0007] 本发明的技术方案如下： 一种CYP2C19*17基因多态性SNaPshot检测方法，其包括如下步骤：首先提取血液基 因组DNA，将其稀释至100 μ g/mL后通过PCR扩增6???1/诉17的序列，PCR扩增产物纯化后 将对应的序列进行SNaPshotPCR扩增，扩增产物纯化后通过毛细管电泳法检测荧光信号并 通过软件分析SNP位点，通过不同的荧光检测结果确定检测SNP位点处碱基变化确定基因 型。
[0008] 作为本发明所优选的一种实施方式，所述的检测方法，具体包括如下步骤： DDNA提取：提取方法参照TIANampBloodDNAkit (购自Tiagen，货号DP318)的说明书， 提取完毕的DNA计算其浓度并稀释至100 μ g/mL ; 2) PCR扩增6???1/诉17的序列：PCR反应体系中组分及体积份数分别为Q5? Master Mixl2. 5份，双蒸水8. 5份，，wardl份，Reversel份；准确量取PCR反应体系23 μ L，向其中 加入2 μ L稀释后DNA模板；置PCR管放于PCR仪上并将反应程序设置如下：1 :98°C，3 min ; 2:98°C，10 sec;3:58°C，30 sec;4:72°C，l min;5:往复进行 35 个循环；6:72°C，5 min; 7 ：25〇C ； 3) PCR扩增产物纯化：取2体积份的ExoSAP-IT和3体积份的ddH20混合配制酶混合 物，按5 μ L分装到新的8连管中，每管加入PCR扩增产物2 μ L，混匀微离心，按以下程序进 行反应：1 :37°C，15 min ;2 :80°C，15 min 3 :4°C ; 4 ) SNaPshotPCR扩增：SNaPshotPCR反应体系中组分及体积份数分别为SnaPshot 1^已(15^1叉2.5份；5\86911611(3；[1^1311打61'1份；？1'；[1116『8]\^叉6『2份；(1(1!1203.5 份；其中引物 为SNE_CYP2C19*17 ;准确量取SNaPshotPCR反应体系9 μ L，向其中加入1 μ L步骤3)得到 纯化产物，混匀微离，按以下程序进行PCRl :96°C，10 sec ;2 :55°C，5 sec ;3 :60°C，30 sec ; 4 :往复进行25个循环；5 :4°C ; 5) SNaPshotPCR产物纯化：向SNaPshotPCR产物中加入1 μ LSAP酶，按以下程序进行反 应：1 :37°C，60 min ;2 :75°C，15 min ;3 :4°C ; 6) SNaPshot分析：步骤5)获得的产物经ABI 3100-XL基因分析仪毛细管电泳法检测 荧光信号，通过GENEMAPPERIDV4. 1软件分析确定SNP位点，通过不同的荧光检测结果确定 检测SNP位点处碱基变化确定基因型。
[0009] 所述的CYP2C19*17基因多态性SNaPshot检测方法，所述检测位点为67/^67诉17: c. -806C>T(SNP:rsl2248560)。
[0010] 所述的CYP2C19*17基因多态性SNaPshot检测方法，所述PCR中扩增CYP2C19*17 的引物对如下：正向引物：GCCCTTAGCACCAAATTCTC(SEQ ID NO. 1);反向引物为： ATTTAACCCCCTAAAAAAACACG(SEQ ID NO. 2)〇
[0011] 所述的CYP2C19*17基因多态性SNaPshot检测方法，SNaPshot中扩增CYP2C19*17 的引物如下：TTTTTTTTTTCAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAG(SEQ ID N0.3)。
[0012] 以上所述的检测方法在CYP2C19代谢相关药物治疗中的应用。
[0013] 本发明提供的CYP2C19*17基因多态性SNaPshot检测方法通过采用PCR对基因位 点进行扩增，本发明提供的检测方法具有高灵敏性、高准确度和高精密性的优点，是一种便 捷可靠的CYP2C19*3基因多态性SNaPshot检测方法。
[0014] 本发明提供的检测方法能够在CYP2C19代谢相关药物治疗前进行67/^67诉17基 因多态性检测，判定患者的药物代谢速率类型，有助于医生为患者正确选择药物并合理调 整药物剂量。
【附图说明】
[0015] 图1为6?° 诉17基因扩增产物测序图。
[0016] 图 2 为 SNaPshot 法检测 6?° 讲17 图。
【具体实施方式】： 实施例1 I. CYP2C19*17基因多态性SNaPshot检测 本检测方法是通过采用PCR法扩增检测位点所在基因片段后采用荧光标记单碱基延 伸技术（SNaPshot)结合毛细管电泳技术进行检测，检测结果采用GENEMPPERID V4. 1进行 分析，根据峰的移动位置确定延伸产物对应的SNP位点。
[0017] 本检测用于检测来源于EDTA抗凝外周血的DNA样本，采用PCR扩增检测位点所在 基因片段后采用荧光标记单碱基延伸技术（SNaPshot)结合毛细管电泳技术进行检测，检 测结果采用GENEMPPERID V4. 1进行分析，根据峰的移动位置确定延伸产物对应的SNP位 点。
[0018] 本检测的检测位点为 67/^67讲 17: c.-806C>T(SNP:rsl2248560)。
[0019] 主要试剂及仪器如下： (1) 引物 本检测所用引物均由自行设计（见表1)，NCBI基因参考序列号如下：NC_000010. 10， NM_000769. 1。PCR引物序列见表1，所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位 点。
[0020] 表1 PCR引物序列
(2) 试剂 本检测DNA提取采用Qiagen公司产品TIANamp Blood DNA Kit，货号DP318 ; PCR扩增采用NEB公司产品Q5?热启动超保真2X Master Mix，货