专利名称：一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能够检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，以及应用此方法制备的体外诊断试剂盒，可以检测出人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。
背景技术：
在本文中，术语“Rh”是恒河猴(Rhesus Macacus)外文名称的头两个字母。RhD抗原自1939年被发现以来，因导致新生儿溶血病、发生血管外迟发性溶血性输血反应而成为红细胞中仅次于ABO血型的重要抗原。Rh血型的抗原性很强，尤其以D抗原最强，仅次于ABO系统的A和B抗原。凡是人红细胞上有RhD抗原者，为Rh阳性，反之为阴性。RhD阴性血型在中国人中所占比例约为3 5%。，属于稀有血型。50% 75%的Rh阴性个体通过输血和妊娠，可受D抗原红细胞免疫而产生抗D ；随着对Rh血型的不断研究，认为Rh血型系统可·能是红细胞血型中最为复杂的一个血型系。世界各国的卫生组织都严格规定，个体在输血时，只能输用Rh阴性血液。Rh血型的发现，对更加科学地指导输血工作和进一步提高新生儿溶血病的实验诊断和维护母婴健康，都有非常重要的意义。Rh抗原是由位于I号染色体短臂上的两个同源及紧密连锁的基因所编码，即RhD和RhCE基因，每个基因都是由10个外显子组成；RhD基因编码D抗原，RhCE基因编码Ce和Ee抗原。RhD和RhCE的外显子与内含子有93. 8%的同源性,外显子I 7编码50 60个氨基酸,外显子8 10编码最后58个残基。两者最显著的区别是内含子4，RhD的内含子4少了约600bp。RhD和RhCE基因分别长57295bp和57831bp，两个基因相隔约30kb，尾对尾形成排列(5’RhD3’-3’RhCE5’)，中间隔差一个功能未知的小膜蛋白I基因(SMP1基因)，RhD基因的两端存在有两个具有98. 6%同源性的区域被称为Rh盒子(Rh boxes) ;RhD阴性的RhD基因缺失,两端的Rh boxes基因部分缺失后熔合形成单一杂合的Rh盒子(Rh box-hybrid),成为RhD阴性基因的特征。见附图I。近年来，研究发现一些血清学初检RhD阴性的个体经过进一步敏感的血清学检验，如吸收放散试验，可以能检出D抗原的存在，即部分RhD阴性个体拥有难以检测出的D抗原。进一步的研究显示,此类D抗原又可以分为部分D(partrial-D)和弱表现型D(weak-D)两种类型；部分D个体制表达部分而非完整的D抗原，在数量和本质上都与RhD阳性的D抗原有区别，而弱D表达的D抗原是完整的与RhD阳性相比，只有在D抗原数量上有显著区别。这两类特殊血型中都可以检出D基因，这就有两个方面值得探讨一是这些个体的基因属于沉默基因或无效基因；二是这些个体并非真实RhD阴性，而是D抗原较弱，一般检测方法未检测到RhD抗原。现已发现RhD阴性的个体中存在着一种重要的RhD的弱表现型DEL(D-elution, elution中文意为洗脱)，DEL在所占比例在不同文献报告中所占的比例也不同，国外报告在黑人和日本人中DEL比例较高，约30 50%，中国人初筛RhD阴性的人群中香港报告DEL占30%，内地占20 30%。目前已证实DEL基因外显子均无缺失，RhD基因表达调控的差异可能是DEL的产生原因，已有的研究显示在中国大陆、中国台湾和日本等地的DEL血型，都是由于在RhD基因第9外显子的1227位发生G > A的突变引起的，导致mRNA产生变异，使蛋白质的表达量减少，但抗原性质未变；而1227位的G > A突变也成为东亚人群的特异的很重要的基因标记。DEL血型引起了日益增加的关注主要源于两个方面一是目前国内外对DEL血型作为RhD阴性血型对待，DEL血液仍用于供给RhD阴性患者使用，但国内外都有越来越多的报道证实RhD阴性患者输用DEL血液后，产生了抗-D抗体或体内抗-D抗体效价升高，可能引起输血反应，成为临床输血中的不安全因素；二是DEL表达的D抗原是完整的D抗原，DEL血型的患者是否能够输用D阳性血液，从而节约宝贵的RhD阴性血液资源？以上的研究都必须对DEL血型进行准确的鉴定，同时大规模的检测也需要采用可靠、简便和经济的方法才能够进行。用免疫血清学的方法对DEL血型的检出有赖于使用的抗-D试剂和操作方法，可靠性较低，而且由于步骤繁琐而不适合临床大规模应用，可靠的方法是应用基因检测的方法·来检出DEL血型。目前，国外已有多种根据1227位发生G > A的突变而设计的检测试剂盒问世，可用于DEL血型的检出，但存在以下缺点I、价格昂贵产自德国的BAG和INN0-TRAIN公司的D基因检测试剂虽然可靠性好，但每人份约需1200 1300人民币元，非常昂贵；产自美国G&T公司试剂，虽然每人份约需100人民币元，但可靠性较差，而且这个价格仍然是大规模检测难以承受的；2、操作繁琐德国的BAG和IVIN公司的D基因检测试剂每人份需要4 8个反应管，而美国G&T公司试剂每人份需要12个反应管，样本DNA和耗材的消耗量很大，而且加样繁琐，容易出错，同时判读困难，不适于大规模的检测工作；3、内对照均为人类生长激素基因，但我们实际使用中发现有内对照有扩增条带，但检测带无扩增产物，不能判断有些阴性结果是否是由于Rh基因降解所致。
发明内容
本发明的目的是为了克服前述试剂的缺点，提供一种经济、简便和直观的分子生物学方法以及实施该方法的试剂盒。本发明涉及一种能够检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，以及为实施该方法制备的体外诊断试剂盒，用于检测人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d 和 d/d 基因型。本发明的方法是利用人类RhD血型不同基因型的特异性序列位点的改变，设计多对引物，进行聚合酶链反应(PCR)来完成的。因此，本发明可被视为是基于PCR-SSP(Sequence specific primer,序列特异性引物)的原理而建立的。利用针对不同位点而设计出序列特异性引物，然后通过优化序列特异性引物的混合比例、反应缓冲液组分和PCR反应条件，从而达到准确检测出人类RhD血型基因型的目的。特别地，发明在已设计出的诸多序列特异性引物中筛选出了一组特异性相对较高的引物，如说明书表I所示的序列，有效地缩短了反应时间。并且优化了混合比例，极大地提高了反应的灵敏度，避免假阳性出现。在本文中，术语“多重PCR”是指通过在同一个反应中同时完成多个基因的扩增的筛选检测方法。研究表明，对于成功进行多重PCR尤为重要的因素是用于扩增不同基因的不同引物对之间的相对浓度、PCR缓冲液的浓度、循环温度、氯化镁和dNTP浓度间的平衡。在一个实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，该方法包括步骤(I)在0.5mL的Ependoff管内加入12.8iil PCR引物缓冲液、2. 0 iU引物混合物、2. Ou IdNTP混合物、0. 2 U I TaqDNA聚合酶和3. 0 模板DNA，充分混合；(2)将Ependoff管放入PCR扩增仪中，94°C变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(94°C、40秒，56 °C、40秒和72°C、1分钟)，随后72°C延伸5分钟，然后将温度降低到4 0C ；(3)取出PCR产物，4%琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍
昭·
>、、、其中，所述PCR 引物缓冲液包含 2. Oil I 500mM KCl, 2. Ou I IOOmM Tris-HCl (PH9. 0) ,2. Ou I 25mMMgCl2、0. I I. OM (NH4) 2S04、0 2. 0 y I DMS0、0 I. 0 y I 甘油和4. 0 6. I ii I DDW。所述引物混合物包含SEQ ID NOU SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ IDN05、SEQ ID N06、SEQ ID N07 和 SEQ ID N08。其中 SEQ ID NOl 和 SEQ ID N02 分别为特异性扩增位于第9外显子的DEL基因的上下游引物，扩增片断长度为102bp;SEQ ID N03和SEQ ID N04分别为扩增位于RhD和RhCE基因第8外显子的上下游引物，作为内对照使用，扩增片断长度为206bp ；SEQ ID N05和SEQ ID N06分别为特异性扩增位于第10外显子的RhD基因的上下游引物，扩增片断长度为261bp ;SEQ ID N07和SEQ ID N08分别为特异性扩增杂合的Rh盒子基因的上下游引物，扩增片断长度为在816bp，序列见表I。这种引物缩短了反应时间，提高了结果特异性。所有引物的浓度均为25pmol/yl，其混合比例为SEQ IDNOl SEQ ID N02 SEQ ID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ IDN07 SEQ ID N08 = 4 4 I I I. 5 I. 5 6. 5 6. 5，司选比例EQ ID NOl SEQID N02 SEQ ID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQID N08 = 3. 5 3. 5 I. 5 I. 5 I. 5 I. 5 : 7 : 7。在另一实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，该方法包括步骤(I)在0. 5mL的Ependoff管内加入12. 8 U IPCR引物缓冲液、2. 0 U I引物混合物、
2.Ou IdNTP混合物、0. 2 u ITaqDNA聚合酶和3. 0 U I模板DNA,充分混合；(2)将Ependoff管放入PCR扩增仪中，94°C变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(94°C、40秒，56 °C、40秒和72°C、1分钟)，随后72°C延伸5分钟，然后将温度降低到40C ;以及(3)取出PCR产物，4%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并拍照；其中，所述PCR 引物缓冲液包含 Oii I 500mM KC1.2. Ou I IOOmM Tris-HCl (PH9. 0) ,2. 6u I 25mM MgCl2^O. 2 u I I. OM(NH4)2SO4U-Ou I DMSO 和 5. 0 y I DDW。所有引物的浓度均为25pmol/iil，所述引物混合物混合比例为SEQ IDNOl SEQIDN02 SEQ ID N03 SEQ IDN04 SEQ IDN05 SEQ IDN06 SEQ IDN07 SEQ IDN08=4 : 4 : I : I : I. 5 : I. 5 : 6. 5 : 6. 5。在另一实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒，该试剂盒包含(I)引物混合物I管；(2) PCR引物缓冲液I管；(3) Taq 聚合酶 I 管；(4) dNTP 混合物 I 管；(5)阳性对照2管，阴性对照I管；以及(6)使用说明书；其中，所述的PCR引物缓冲液包含2.Oii I 500mM KCl,2. Ou I IOOmM Tris-HCl (PH9. 0) ,2. Ou I 25mMMgCl2、0. I I. 0M(NH4)2S04、0 2. 0 y I DMS0、0 I. 0 y I 甘油和
4.0 6. I ii I DDff ；所述引物混合物包含SEQ ID NOU SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQID N05、SEQ ID N06、SEQ ID N07 和 SEQ ID N08。其中 SEQ ID NOl 和 SEQ ID N02 分别为特异性扩增位于第9外显子的DEL基因的上下游引物，扩增片断长度为102bp ；SEQ IDN03和SEQ ID N04分别为扩增位于RhD和RhCE基因第8外显子的上下游引物，作为内对照使用，扩增片断长度为206bp ;SEQ ID N05和SEQ ID N06分别为特异性扩增位于第10外显子的RhD基因的上下游引物，扩增片断长度为261bp ;SEQ ID N07和SEQ ID N08分别为特异性扩增杂合的Rh盒子基因的上下游引物，扩增片断长度为在816bp，序列见表
I。所有引物的浓度均为25pmol/iil，其混合比例为SEQ ID NOl SEQ ID N02 SEQID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ IDN06 SEQ ID N07 SEQ ID N08 =4 4 I I I. 5 I. 5 6. 5 6. 5，可选比例EQ ID NOl SEQ ID N02 SEQIDN03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQ ID N08 =
3.5 : 3. 5 : I. 5 : I. 5 : I. 5 : I. 5 : 7 : 7。在本发明的另一实施方式中，本发明一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒，该试剂盒包含(I)引物混合物I管；⑵PCR弓丨物缓冲液I管；(3) Taq 聚合酶 I 管；(4) dNTP 混合物 I 管；(5)阳性对照2管，阴性对照I管；以及(6)使用说明书；其中，所述PCR 引物缓冲液包含 Oii I 500mM KCl, 2. 0 u IlOOmM Tris-HCl (PH9. 0) ,2. 6u I 25mM MgCl2^O. 2 u I I. OM(NH4)2SO4U-Ou I DMSO 和 5. 0 y I DDW。所述引物混合物包含SEQ ID N01、SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ IDN05、SEQ IDN06、SEQ ID N07 和 SEQ ID N08。混合比例为SEQ ID NOl SEQ ID N02 SEQID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQ ID N08 =4 : 4 : I : I : I. 5 : I. 5 : 6. 5 : 6. 5。在本发明另一实施方式中，本发明还涉及所述试剂盒在检测人类RhD血型基因型中的用途。试剂盒为体外诊断试剂盒，用于检测人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。
本发明的一个或多个实施方式的细节在附图和下面的说明中有描述。通过阅读附图、详细描述和权利要求可以清楚地了解本发明的其他特征、目的和优点。
附图I描述的是Rh血型基因组结构图。RhD和RhCE基因尾对尾形成排列(5’ RhD3’ -3’ RhCE5’ )，中间隔差一个功能未知的小膜蛋白I基因(SMP1基因)，RhD基因的两端存在有两个具有98. 6%冋源性的区域被称为Rh盒子(Rh boxes);从图中可以看到RhD阴性的RhD基因缺失,两端的Rh boxes基因部分缺失后熔合形成单一杂合的Rh盒子(Rh box-hybrid),成为RhD阴性基因的特征。附图2为单对引物的PCR反应电泳图，通过单对引物的PCR反应结果，A为SEQIDNOl和SEQ ID N02扩增结果，产物大小为102bp,与目标产物相符；B为SEQ IDN03和SEQIDN04、SEQ IDN05和SEQ ID N06扩增结果，都获得了目的片断；C为SEQ ID N07和SEQ IDN08扩增结果，比对DL2000的标尺，产物大小为800bp左右，与目的片断的大小相符，说明设计的引物合适。·附图3为本试剂盒检测RhD基因型电泳图，其中，M :Marker，Takara，DL2000。1、2为INN0-TRAIN公司的标准质控对照，I为D/d型，2为d/d型，3 8为待测样本，3为D/D，4为D/d，5为del/d，6为d/d，7为del/d，8为d/d。描述的是检测本试剂盒灵敏度和特异性的试验结果，判定格局为D/d型，目标条带为3条,分别为206bp、261bp和816bp ;d/d型，目标条带为2条，分别为206bp和816bp ；D/D型，目标条带为2条，分别为206bp和261bp。DEL/d,目标条带为4条，分别为102bp、206bp、261bp和816bp ;根据不同的条带可以判断出检测结果，INN0-TRAIN公司的标准质控对照D/d型和d/d型也被准确检出。附图4为INN0-TRAIN公司试剂盒RhD基因分型电泳图。描述的是用本发明试剂检出的D/d型、DEL/d型和d/d型用INN0-TRAIN公司的D基因检测试剂盒进行复检，根据表2的格局判断结果，两种试剂盒结果相符。
具体实施例方式本发明涉及一种能够检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法以及用于实施该方法的体外诊断试剂盒。本发明的方法和试剂盒可用于检出人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d 和 d/d 基因型。本发明的方法是利用人类RhD血型不同基因型的特异性序列位点的改变，设计多对引物，进行聚合酶链反应(PCR)来完成的。因此，本发明可被视为是基于PCR-SSP(Sequence specific primer,序列特异性引物)的原理而建立的。利用针对不同位点而设计出序列特异性引物，然后通过优化序列特异性引物的混合比例、反应缓冲液组分和PCR反应条件，从而达到准确检测出人类RhD血型基因型的目的。本发明的基础部分在于对Rh血型基因的认识。Rh抗原是由位于I号染色体短臂上的两个同源及紧密连锁的基因所编码，即RhD和RhCE基因，每个基因都是由10个外显子组成；RhD基因编码D抗原，RhCE基因编码Ce和Ee抗原。RhD和RhCE的外显子与内含子有93. 8%的同源性。RhD和RhCE基因分别长57295bp和57831bp，两个基因相隔约30kb，尾对尾形成排列(5’ RhD3’ -3’ RhCE5’ )，中间隔差一个功能未知的小膜蛋白I基因(SMP1基因)，RhD基因的两端存在有两个具有98. 6%同源性的区域被称为Rh盒子(Rh boxes) ;RhD阴性的RhD基因缺失，两端的Rh boxes基因部分缺失后熔合形成单一杂合的Rh盒子(Rh box-hybrid),成为RhD阴性基因的特征。中国大陆、中国台湾和日本等地的DEL血型，都是由于在RhD基因第9外显子的1227位发生G > A的突变引起的，导致mRNA产生变异，使蛋白质的表达量减少，但抗原性质未变；而1227位的G > A突变也成为东亚人群的特异的很重要的基因标记。因此，设计出的引物必须能够特异性地扩增出RhD基因而非RhCE基因，同时还能够对不同的D基因型加以区分。原理见附图2。在一个实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，基于对PCR-SSP以及由此发展出的多重PCR原理的应用。成功进行多重PCR尤为重要的因素是用于扩增不同基因的不同引物对之间的相对浓度、PCR缓冲液的浓度、循环温度、氯化镁和dNTP浓度间的平衡。该方法包括步骤(I)在0.5mL的Ependoff管内加入12.8iil PCR引物缓冲液、2. 0 iU引物混合物、2. Ou IdNTP混合物、0. 2 U I TaqDNA聚合酶和3. 0 模板DNA，充分混合；·(2)将Ependoff管放入PCR扩增仪中，94°C变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(94°C、40秒，56 °C、40秒和72°C、1分钟)，随后72°C延伸5分钟，然后将温度降低到4 0C ；(3)取出PCR产物，4%琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照。其中，缓冲液基于普通PCR缓冲液的基本配方(KCl+Tris-HCl)添加佐剂而配制，在实施方式中，试验过不同浓度的甘油、DMSO、(NH4)2SOjP BSA等佐剂。虽然在多重反应中，有报道5%-10%的DMSO和甘油可以改善扩增的效率(提高产物量)和特异性(没有非特异性产物)。本发明所述PCR引物缓冲液包含2. OiU 500mM KC1.2. Ou I IOOmMTris-HCl (PH 9. 0) ,2. Ou I 25mM MgCl2^O. 2 u I I. OM (NH4)2 SO4、0 2. 0 y I DMS0、0 l.Oul 甘油和 4. 0 6. I ii I DDff0所述引物混合物包含SEQ ID NOU SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ IDN05、SEQ ID N06、SEQ ID N07 和 SEQ ID N08。其中 SEQ ID NOl 和 SEQ ID N02 分别为特异性扩增位于第9外显子的DEL基因的上下游引物，扩增片断长度为102bp;SEQ ID N03和SEQ ID N04分别为扩增位于RhD和RhCE基因第8外显子的上下游引物，作为内对照使用，扩增片断长度为206bp ；SEQ ID N05和SEQ ID N06分别为特异性扩增位于第10外显子的RhD基因的上下游引物，扩增片断长度为261bp ;SEQ ID N07和SEQ IDN08分别为特异性扩增杂合的Rh盒子基因的上下游引物，扩增片断长度为在816bp，序列见表I。所有引物的浓度均为25pmol/iil，在实施方式中，试验了多种不同引物对之间的相对浓度，采用同一模板(已知D基因型)和反应条件下，对比产物的均衡性，最终确定了引物的的最佳比例。其混合比例为SEQ IDNOl SEQID N02 SEQ ID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ IDN06 SEQ ID N07 SEQ ID N08 = 4 4 I I I. 5 I. 5 6. 5 6. 5，可选比例EQ ID NOl SEQ ID N02 SEQ ID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQID N07 SEQ IDN08 = 3. 5 : 3. 5 : I. 5 : I. 5 : I. 5 : I. 5 : 7 : 7。反应条件如下94°C变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(94°C、40秒，5640秒和72°C、1分钟)，随后72°C延伸5分钟，然后将温度降低到4°C。可选反应条件为94°C变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(94°C、35秒，55°C >40秒和72°C、I分钟)，随后72°C延伸5分钟，然后将温度降低到4°C。取出PCR产物，4%琼脂糖凝胶电泳(200V, 20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照；在另一实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，该方法包括步骤(I)在0.5mL的Ependoff管内加入12.8iU PCR引物缓冲液、2. 0 iU引物混合物、
2.Ou IdNTP混合物、0. 2 U I TaqDNA聚合酶和3. 0 模板DNA，充分混合；(2)将Ependoff管放入PCR扩增仪中，94°C变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(94°C、40秒，56 °C、40秒和72°C、1分钟)，随后72°C延伸5分钟，然后将温度降低到4 0C ；
(3)取出PCR产物，4%琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍昭.
>、、、 在本发明中，5%的DMSO是反应的最佳浓度，增加和减少都对反应不利。而甘油的添加对反应会产生抑制作用。同样有描述BSA比加入DMSO和甘油更能提高PCR扩增的效率，但在本发明中没有作用。本发明所述PCR引物缓冲液包含.OiU 500mM KCl,2.0u IIOOmM Tris-HCl (PH 9. 0) ,2. 6u I 25mM MgCl2^O. 2 u I I. OM(NH4)2SO4U-Ou I DMSO 和
5.Ou I DDW。所有引物的浓度均为25pmol/iil，所述引物混合物混合比例为SEQ IDNOl SEQIDN02 SEQ ID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQ IDN08 = 4 : 4 : I : I : I. 5 : I. 5 : 6. 5 : 6. 5。在另一个实施方式中提供了本发明不同退火温度下的反应结果，尽管许多基因能在退火温度为56°C 60°C被特异的扩增，我们的经验表明，，当同时扩增许多特异的基因时，扩增效率高的基因会使扩增效率低的基因的扩增产量降低。将退火温度降低4°C 6°C对于在多重PCR中扩增出同样的基因是必需的。过低的退火温度会出现非特异性的扩增条带，高的退火温度会导致扩增缺失。最终确定的反应条件如下94°C变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(94°C、40秒，56 °C、40秒和72°C、1分钟)，随后72°C延伸5分钟，然后将温度降低到4°C。在另一实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒，该试剂盒包含(I)引物混合物I管；(2) PCR引物缓冲液I管；(3) Taq 聚合酶 I 管；(4) dNTP 混合物 I 管；(5)阳性对照2管，阴性对照I管；以及(6)使用说明书；其中，所述的PCR引物缓冲液包含2.Oii I 500mM KCl,2. Ou I IOOmM Tris-HCl (PH9. 0) ,2. Ou I 25mMMgCl2、0. I I. 0M(NH4)2S04、0 2. 0 y I DMS0、0 I. 0 y I 甘油和
4.0 6. I ii I DDff ；所述引物混合物包含SEQ ID NOU SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQID N05、SEQ ID N06、SEQ ID N07 和 SEQ ID N08。其中 SEQ ID NOl 和 SEQ ID N02 分别为特异性扩增位于第9外显子的DEL基因的上下游引物，扩增片断长度为102bp ；SEQ IDN03和SEQ ID N04分别为扩增位于RhD和RhCE基因第8外显子的上下游引物，作为内对照使用，扩增片断长度为206bp ;SEQ ID N05和SEQ ID N06分别为特异性扩增位于第10外显子的RhD基因的上下游引物，扩增片断长度为261bp ;SEQ ID N07和SEQ ID N08分别为特异性扩增杂合的Rh盒子基因的上下游引物，扩增片断长度为在816bp，序列见表
I。所有引物的浓度均为25pmol/iil，其混合比例为SEQ ID NOl SEQ ID N02 SEQID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQ ID N08 =
4 4 I I I. 5 I. 5 6. 5 6. 5，可选比例EQ ID NOl SEQ ID N02 SEQID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQ ID N08 =
3.5 : 3. 5 : I. 5 : I. 5 : I. 5 : I. 5 : 7 : 7。
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在本发明的另一实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒，该试剂盒包含(I)引物混合物I管；(2) PCR引物缓冲液I管；(3) Taq 聚合酶 I 管；(4) dNTP 混合物 I 管；(5)阳性对照2管，阴性对照I管；以及(6)使用说明书；其中，所述PCR 引物缓冲液包含 2. Oii I 500mM KCl, 2. Ou I IOOmM Tris-HCl (PH9. 0) ,2. 6u I 25mMMgCl2、0. I I. OM(NH4)2SO4U-Ou I DMSO 和 5. 0 y I DDW。所述引物混合物包含SEQ ID NOU SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQID N05、SEQ ID N06、SEQ ID N07 和 SEQ ID N08。混合比例为SEQ ID NOl SEQ IDN02 SEQ ID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQ IDN08 = 4 : 4 : I : I : I. 5 : I. 5 : 6. 5 : 6. 5。反应条件如下94°C变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(94°C、40秒，560C >40秒和72°C、I分钟)，随后72°C延伸5分钟，然后将温度降低到4°C。取出PCR产物，4%琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照；在本发明另一实施方式中，本发明还涉及所述试剂盒在检测人类RhD血型基因型中的用途。试剂盒为体外诊断试剂盒，用于检测人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。包含本发明所使用的多种其他试剂，如dNTP-Mix和Taq酶为非限制性的。现在已经一般性地描述了本发明，通过参考下面的实施例可以更容易地理解本发明，下面的实施例是通过说明的方式提供的，并不意味着对本发明的限制，除非特别说明。实施例实施例I引物序列的设计根据特异性的位点设计的弓丨物序列，所述引物混合物包含SEQ ID NOl、SEQ IDN02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ ID N06、SEQ ID N07 和 SEQ ID N08。其中SEQ ID NOl和SEQ ID N02分别为特异性扩增位于第9外显子的DEL基因的上下游引物，SEQ ID NOl最末碱基针对1227位发生G > A的突变而设计，SEQ ID N02位于第9、10外显子之间的内含子中，引物扩增片断长度为102bp;SEQ ID N03和SEQ ID N04分别为扩增位于RhD和RhCE基因第8外显子的上下游引物，作为内对照使用，扩增片断长度为206bp ；SEQ ID N05和SEQ ID N06分别为特异性扩增位于第10外显子的RhD基因的上下游引物，扩增片断长度为261bp ；SEQ ID N07和SEQ ID N08分别为特异性扩增杂合的Rh盒子基因的上下游引物，扩增片断长度为在816bp，序列见表I。表I本发明弓丨物序列表
引物名称引物序列产物大小引物特异性
SEQ ID N01 5'-ATGACCAAGTnTCTGGAAA-3'
102bpDEL 基因·
SEQ ID N02 5_-CAGCAAGTCAACATATATACT-3'
SEQ ID N03 S'-ACTGACACCGACAGTCCTT-S'
206bp内对照SEQ ID N04 5'-GCTGTGTCCTGGCAATGGT-3’
SEQ ID N055'-GTAATGAGACATTTAGGCT-3’
261 bpD基因
SEQ ID N06 S'-CAACTCCATmCTCTGACT-S'
SEQ ID N07 5’-ACCTGGCCGCAACTGATTTT-3’Rh box.hybrjd
816bp
SEQ ID N08 S'-GCGGTGCATTAGCCGATTAG-S'(RhD阴ft)实施例2单对引物的PCR反应通过单对引物的PCR反应来验证引物设计的合理性，以最终确定能够用于多重PCR反应的引物组分。试验材料为d/d、D/d和DEL型DNA，反应缓冲液为普通PCR缓冲液，Taq酶购自上海Promega公司，dNTP购自北京鼎国生物科技公司。反应体系为20yl :在0. 5mL的EpendofT管内加入 l.Oul 引物、2. OiUPCR 缓冲液、2. OiU 25mM MgCl2、I. 0 yldNTP 混合物、0. 2 ylTaq DNA聚合酶、3. 0 U I模板DNA和11. 8 yl双蒸水，充分混合；根据引物的Tm值确定退火温度，反应条件分别如下SEQ ID NOl和SEQ ID N02 :94°C变性5分钟，然后进行30个循环的PCR反应(940C >30秒，60。。、30秒和72 °C >30秒)，随后72°C延伸5分钟，然后将温度降低到4°C。SEQ ID N03和SEQ ID N04 :94°C变性5分钟，然后进行30个循环的PCR反应(940C >30秒，55 0C >30秒和72 °C >30秒)，随后72°C延伸5分钟，然后将温度降低到4°C。SEQ ID N05和SEQ ID N06 :94°C变性5分钟，然后进行30个循环的PCR反应(940C >30秒，56 0C >30秒和72 °C >30秒)，随后72°C延伸5分钟，然后将温度降低到4°C。SEQ ID N07和SEQ ID N08 :94°C变性5分钟，然后进行30个循环的PCR反应(940C >30秒，59 0C >30秒和72。。、I分钟)，随后72°C延伸5分钟，然后将温度降低到4°C。取出PCR产物，琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并拍照；反应结果见附图2，可见都有目的条带，说明引物设计合理，可以扩增出目的条带。
实施例3本发明与其他试剂盒对比在本发明的另一实施方式中，本发明一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒，该试剂盒包含引物混合物I管；PCR引物缓冲液I管；Taq聚合酶I管；dNTP混合物I管；阳性对照2管，阴性对照I管；以及使用说明书；其中，所述PCR引物缓冲液包含2. O ill 500mMKCU2. Ou I IOOmM Tris-HCl (PH 9. 0),2. 6 u I 25mMMgCl2,0. 2u 11. OM(NH4)2SO4U-Ou IDMSO和5. 0 ill DDW。待检DNA包括有INNO-TRAIN公司的标准质控对照，D/d型和d/d型；按照使用说明书，在0. 5mL的Ependoff管内加入12. 8u I PCR引物缓冲液、2. Oyl引物混合物、2. 0 u IdNTP混合物、0. 2 ill Taq DNA聚合酶和3. 0 yl模板DNA，充分混合；反应条件如下94°C变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应(94°C、40秒，56°C >40秒和72°C、I分钟)，随后72°C延伸5分钟，然后将温度降低到4°C ;取出PCR产物，4%琼脂糖凝胶电泳(200V,20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照。INN0-TRAIN公司的检测试剂盒可以检出RhD基因型，，其使用方法如下取I. 5ml离心管I支,按照样本的多少(设为X个样本)加双蒸水42X ill、试剂盒的红色反应液(redPCR)21Xu I、Taq酶(5U/u 1)0. 56Xu 1，混匀备用；PCR反应液配制根据样本数的多少，取X支I. 5ml离心管，并标记好样本编号，每管加入63 u I前述配制的混合液，在加入7iUDNA，混匀。将样本加入试剂盒的反应管中，10 iil/孔，共6孔。反应条件如下94°C变 性2分钟，然后进行10个循环的PCR反应(94°C、20秒和65°C、I分钟)，20个循环的PCR反应(94°C、20秒，61°C、1分钟和72°C、30秒)，随后72°C延伸5分钟，然后将温度降低到4°C。根据其反应格局判断检测结果，其反应格局见表2表2INN0-TRAIN试剂盒反应格局
权利要求
1.一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒，该试剂盒包含 (1)引物混合物I管； 所述引物混合物由下列序列组成SEQ ID NOUSEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ ID N06、SEQ IDN07和SEQ ID N08，其序列见说明书中表I。
(2)PCR引物缓冲液I管； (3)Taq聚合酶I管； (4)dNTP混合物I管； (5)阳性对照2管，阴性对照I管；以及 (6)使用说明书。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于引物混合物的混合比例为SEQIDNOl SEQ ID N02 SEQ ID N03 SEQIDN04 SEQIDN05 SEQIDN06 SEQIDN07 SEQIDN08 = 4 : 4 : I : I : I. 5 : I. 5 : 6. 5 : 6. 5。
3.如权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于PCR引物缓冲液包含2.0 ill 500mMKC1.2. Ou I IOOmMTris-HCl (PH 9. 0) ,2. Ou I 25mM MgCl2^O. 2 u I I. OM(NH4)2SO4^O ·2.Ou I DMS0、0 ~ I. Ou I 甘油和 4. 0 6. I ii I DDW。
4.如权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，其中所述的所述PCR引物缓冲液包含 2. Oii I 500mMKCl、2. Oii I IOOmM Tris-HCl (PH 9. 0) ,2. 6u I 25mM MgCl2^O. 2 u I·1.OM(NH4)2SO4U-Ou I DMSO 和 5. Oii I DDW。
5.一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，该方法包括步骤 (1)在0.5mL的Ependoff管内加入12.8u I PCR引物缓冲液、2. O yl引物混合物、·2.Ou IdNTP混合物、0. 2 U I TaqDNA聚合酶和3. O 模板DNA，充分混合，所述引物混合物由下列序列组成SEQ ID NOUSEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ IDN06、SEQ ID N07和SEQ ID N08，其序列见说明书中表I ; (2)将Ependoff管放入PCR扩增仪中，94°C变性5分钟，然后进行35个循环的PCR反应94°C、40秒，56 °C、40秒和72 °C、I分钟，随后72 V延伸5分钟，然后将温度降低到4 V ；以及 (3)取出PCR产物，4%琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述PCR引物缓冲液包含2.OiU 500mMKC1.2. Ou I IOOmMTris-HCl (PH 9. 0) ,2. Ou I 25mM MgCl2^O. 2 u I I. OM (NH4)2SO4'O ·2.Ou I DMS0、0 ~ I. Ou I 甘油和 4. O 6. I ii 1DDW。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，其中所述PCR引物缓冲液包含2.O ill·500mM KC1.2. Ou I IOOmM Tris-HCl (PH 9. 0) ,2. 6u I 25mM MgCl2^O. 2 u I I. OM(NH4)2SO4,·I.Oii I DMSO 和 5. Oii I DDff0
8.如权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，其中所述引物混合物包含SEQ ID NOl、SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ ID N06、SEQ IDN07和SEQ ID N08，本发明提供的最佳混合比例为SEQ ID NOl SEQ ID N02 SEQID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQ ID N08 =·4 : 4 : I : I : I. 5 : I. 5 : 6. 5 : 6. 5。
9.如权利要求1-4中任一权利要求所述的试剂盒用于检测人类RhD血型基因型，可以检测出人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。
全文摘要
本发明涉及一种能够检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法，以及应用此方法制备的体外诊断试剂盒，可以检测出人类RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。本发明的方法是利用人类RhD血型不同基因型的特异性序列位点的改变，设计多对引物，进行聚合酶链反应(PCR)来完成的。因此，本发明可被视为是基于PCR-SSP(Sequence specific primer，序列特异性引物)的原理而建立的。利用针对不同位点而设计出序列特异性引物，然后通过优化序列特异性引物的混合比例、反应缓冲液组分和PCR反应条件，从而达到准确检测出人类RhD血型基因型的目的。在一个实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的多重PCR方法；在另一实施方式中，本发明提供了一种检测人类RhD血型基因型的试剂盒。本发明的一个或多个实施方式的细节在附图和说明中有描述。通过阅读附图、详细描述和权利要求可以清楚地了解本发明的其他特征、目的和优点。
文档编号C12Q1/68GK102787171SQ20121032545
公开日2012年11月21日 申请日期2012年9月5日 优先权日2012年9月5日
发明者叶世辉, 吴大洲, 左琴琴, 徐华, 段勇, 王满妮 申请人:陕西省血液中心