专利名称：一株放射形根瘤菌及其胞外多糖与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株新的放射形根瘤菌菌株和由该菌株发酵产生的胞外多糖，以及该多糖的制备方法和应用。
背景技术：
众所周知，某些特定的微生物(如乳酸菌、土壤杆菌、根瘤菌)在生长过程中，可以产生多种类型的多糖，根据这些多糖所处的位置，可以分为荚膜多糖和分泌到生长环境中的多糖，又称为胞外多糖。这些多糖对产生菌在自然环境中具有保护作用，可以使产生菌避免受到干燥、紫外辐射、渗透压变化、抗生素、噬菌体侵染所引起的伤害以及在体内抗吞噬作用。最近的研究发现，部分土壤杆菌所产生的胞外多糖具有作为增稠剂和/或胶凝剂的作用，如放射形土壤杆菌1-2001菌株(放射形根瘤菌旧称为放射形土壤杆菌)所产生的胞外多糖在膳食制品中用于高端配料的制作。因此，这些微生物来源的多糖成为某些增稠剂和 /或胶凝剂的重要来源，开发和利用这些胞外多糖也日益成为食品添加剂研究领域的前沿。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的放射形根瘤菌菌株和由该菌株所产生的胞外多糖，以及该胞外多糖的制备方法和应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。本发明提供的技术方案之一是一株新的放射形根瘤菌菌株，其是保藏号为CGMCCNO. 4524 的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO 菌株。该菌株经16S rRNA基因测序的结果如SEQ ID NO. I所示。本发明提供的技术方案之二是一种放射形根瘤菌的胞外多糖，所述的胞外多糖主要由半乳糖和葡萄糖组成，所述的半乳糖和葡萄糖的摩尔比为I. 00 4. 60 6. 40，该胞外多糖的平均重量分子量在3. 5 X IO3 3. 8 X IO6道尔顿之间。本发明中，所述的胞外多糖为一种纯白色的丝状物或粉末，在λ=195ηπι处有强烈的吸收；10. Omg/mL的所述多糖的水溶液澄清透明、无色、无味，pH值为6. O 7. I。本发明中，所述的胞外多糖可以由前述保藏号为CGMCC NO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO菌株产生,也可以由其它的可以产胞外多糖的放射形根瘤菌菌株产生。较佳地，所述的胞外多糖由前述保藏号为CGMCC NO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO 菌株所产生。本发明中，较佳地，所述的胞外多糖中平均重量分子量在2. OXlO6 3. 8 X IO6道尔顿之间的胞外多糖占80 85%，平均重量分子量在3. 5 X IO3 2. OX IO6道尔顿之间的胞外多糖占15 20%，以上百分比均指占总的胞外多糖的重量百分比。在本发明的一较佳实例中，本发明的放射形根瘤菌胞外多糖中的半乳糖和葡萄糖的摩尔比为I. 00 5. 19 ;平均重量分子量为3，377，709道尔顿的胞外多糖占83. 97%，平均重量分子量为6，596道尔顿的胞外多糖占16. 03%,以上百分比均指占总的胞外多糖的重量百分比。
在本发明的另一较佳实例中，本发明的放射形根瘤菌胞外多糖中的半乳糖和葡萄糖的摩尔比为I. 00 5. 23 ;平均重量分子量为2，948，419道尔顿的胞外多糖占87. 90%，平均重量分子量为3，578道尔顿的胞外多糖占12. 10%,以上百分比均指占总的胞外多糖的重
量百分比。本发明提供的技术方案之三是一种放射形根瘤菌胞外多糖的制备方法。本发明中，所述的制备方法可以是将所述的放射形根瘤菌按照现有技术内常规的培养方法培养得到发酵液，然后将发酵液采用常规的多糖分离方法分离得到胞外多糖。较佳地，所述的制备方法包括如下步骤I)发酵，即将放射形根瘤菌于24 38°C下，在无菌培养基中发酵24 120小时得发酵液；其中，所述的无菌培养基为下列任一种①固形物含量为3 12%(w/w)的脱脂乳；②3 12%(w/w)脱盐乳清和③常规的用于培养放射形根瘤菌的无菌合成培养基； 2)灭酶，即将步骤I)制得的发酵液在95 100°C加热10 30分钟，以灭活发酵液中使多糖发生降解的酶；3)收获上清液，即在经过步骤2)灭酶处理后的发酵液中加入三氯乙酸，使其终浓度达到4 10% (w/v)，静置8 16小时，离心获得发酵上清液；4)沉淀、透析和干燥，即在步骤3)获得的上清液中加入2 4倍体积的体积百分数为80 100%的乙醇，离心或过滤收集沉淀物并将沉淀物溶于蒸馏水，用截留分子量为10, 000D的透析袋在蒸馏水中透析48 72小时，每12 24小时换水一次，在温度不超过105°C下干燥或者真空冷冻干燥得胞外多糖粗品。本发明中，所述的胞外多糖粗品包括85 95%的前述放射形根瘤菌胞外多糖和5 15%的游离蛋白，所述的百分比为质量百分比。本发明中，步骤I)中所述常规的用于培养放射形根瘤菌的无菌合成培养基由碳水化合物、氮源和无机盐组成；较佳地，所述的碳水化合物选自葡萄糖、蔗糖和乳糖中的任一种或多种，所述的氮源选自胰蛋白胨和/或酵母浸出物，所述的无机盐选自MgCl2和磷酸盐中的任一种或多种；更佳地，所述的限定化学组成的无菌合成培养基包括下列各组分10g/L蔗糖，3g/LKH2P04，5g/LNa2HP04，2. 5g/L蛋白胨和 O. 25g/L MgSO4 ·7Η20，其pH值为 7. O。本发明中，所述的步骤I)还可以为将用平板培养活化后的放射形根瘤菌接种于所述的无菌培养基中，用同样的培养条件培养得到含有多糖的发酵液；或者，将所述的放射形根瘤菌接种于所述的无菌培养基中发酵6 48小时，获得发酵种子液，再将发酵种子液接种于上述无菌培养基发酵,得到发酵液。在本发明的一较佳实例中，所述的步骤I)为将保藏号为CGMCC NO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO菌株于24 38°C下，在所述无菌培养基中发酵6 48小时，获得发酵种子液，再按O. 5 8% (v/v)的接种量接种于所述的无菌培养基发酵，得到发酵液。更佳地，所述的步骤I)为将保藏号为CGMCC NO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO菌株于26 35°C下，在所述无菌培养基中发酵20 26小时，获得发酵种子液，再按2 4%(v/v)的接种量接种于所述无菌培养基发酵，得到发酵液。最佳地，所述的步骤I)为将保藏号为CGMCC NO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO菌株于28 33°C下，在所述无菌培养基中发酵24小时，获得发酵种子液，再按3% (v/v)的接种量接种于所述无菌培养基发酵，得到发酵液。在本发明的另一较佳实例中，本发明的制备方法包括如下步骤I)将保藏号为 CGMCC NO. 4524 的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO 菌株于24 38°C下，在无菌培养基中发酵24 120小时得发酵液；2)将上述发酵液在95 100°C加热10 15分钟，然后离心或过滤获得发酵上清液；3)加入2 3倍体积的体积百分数为95%乙醇于上述发酵上清液中，离心或过滤收集沉淀物，在温度不超过105°C下干燥得胞外多糖粗品；其中，步骤I)所述发酵的温度优选25 35°C，更优选28°C;所述发酵的时间优选24 120小时，更优选120小时。
本发明所获得的胞外多糖粗品可以直接碾碎进行包装，也可以作为增稠剂、胶凝剂或多糖粉的生产原料使用。本发明中，较佳地，在步骤4)之后还包括步骤5):将制得的胞外多糖粗品进行进一步的纯化，以去除蛋白和其它杂质。本发明中，所述进一步的纯化可以是现有技术中的任何常规的分离纯化的步骤。较佳地，所述进一步的纯化是采用三氯乙酸法去除蛋白和采用透析法去除其它杂质。所述的三氯乙酸法为将胞外多糖粗品用50 80°C蒸馏水溶解，使胞外多糖粗品的终浓度为
O.3 I. 5% (w/w)，待溶液冷却至15 25°C时加入三氯乙酸，使三氯乙酸的最终质量浓度为4 10%，再将溶液于O 8°C放置过夜，离心或过滤去除沉淀物。所述的透析法为将去除沉淀后的胞外多糖溶液用截留分子量为10，000道尔顿的透析膜在O 8°C透析48 72小时；在透析过程中较佳地还可以进行多次换水。更佳地，步骤5)还包括，经过透析后的多糖溶液还可以采用凝胶排阻层析的方法进行更进一步的纯化。本发明中，纯化后的多糖溶液可进行干燥以获得粉末状的多糖，干燥方法可以为本领域常规，较佳地选自热风干燥、低温干燥、冷风干燥、冷冻干燥、真空干燥和真空冷冻干燥中的任一种，更佳的干燥方法选自冷风干燥、冷冻干燥、真空干燥和真空冷冻干燥中的任一种。本发明提供的技术方案之四是一种增稠组合物，其包括前述胞外多糖和生理学上可接受的载体。本发明中，所述的生理学上可接受的载体为常规，可以是食品领域常规的增稠剂辅料，如食品胶、淀粉等，也可以是其他领域符合国家相应标准的增稠剂辅料。本发明提供的技术方案之五是前述胞外多糖或增稠组合物在食品、医药和相关领域的应用。本发明中，由于放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter)S10胞外多糖或多糖粗品能很好的溶于水形成胶态水溶性聚合物，能在低浓度时具有很高的粘度、很好的表面活性、很好的蛋白质可混性以及极好的稳定性/乳化性。基于这些性质，本发明所述胞外多糖或胞外多糖粗品可以被用作增稠剂、稳定剂、悬浮剂、乳化剂或润滑剂及其相关用途。本发明的积极进步效果在于本发明公开了一株新的放射形根瘤菌菌株及其胞外多糖与应用，同时公开了该菌株胞外多糖的制备方法。本发明所述菌株的胞外多糖水溶性好，且在低浓度时具有很好的粘度、彳艮好的表面活性、很好的蛋白质可混性以及极好的稳定性/乳化性。本发明人经过严密的实验分析了所述胞外多糖的理化性质，并且验证了其作为食品添加剂和化妆品添加剂的效果，表明其具有广阔的应用前景。牛物材料的保藏本发明的放射形根瘤菌菌株，于2010年12月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO. 4524,名称为放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) S10。
以下结合
本发明的特征和有益效果。 图I为本发明放射形根瘤菌SlO胞外多糖粗品在DEAE-S印harose CL-6B离子交换柱上的洗脱曲线图；其中，纵坐标为洗脱液经过硫酸-苯酚比色法在n=490nm处的光吸收值0D,横坐标为试管号。图2为本发明放射形根瘤菌SlO胞外多糖带电荷部分峰2在S印harose4B分子筛凝胶柱上的洗脱曲线图；其中，纵坐标为洗脱液经过硫酸-苯酚比色法在n=490nm处的光吸收值0D,横坐标为试管号。图3为不同浓度下本发明放射形根瘤菌SlO胞外多糖粗品在不同剪切速率下(I/s)的粘度，其中浓度从上到下分别为O. 25%,O. 5%, I. 0%，测定温度为25。。。图4为不同转速下(Ι/s)各样品的粘度值；其中系列C为发酵乳1，系列I为发酵乳2，系列2为发酵乳3，系列3为发酵乳4。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择；下列实施例中未特别说明的实验材料，均常规市售可得。实施例I菌株的获得本发明中的放射形根瘤菌菌株可通过如下途径获得从新疆伊宁采集的开菲尔发酵乳中取出开菲尔颗粒，在无菌生理盐水中用无菌药勺捣碎，然后以无菌生理盐水系列稀释，取ImL稀释后的菌液加入到培养皿中，注入46°C、含有2% (w/v)脱脂乳的琼脂平板培养基中，待平板完全凝固后，30°C培养48小时。选取拉丝性好、呈黏液状且有明显突起的菌落，转接到含10% (w/v)灭菌脱脂乳的液体培养基中，30°C培养48小时，加入三氯乙酸，使其终浓度达到4% (w/v)，4°C静置10小时，离心(4°C，9000rpm)取上清加入3倍体积预冷的乙醇沉淀过夜，离心(4°C，9000rpm)取沉淀，透析冻干，即为胞外多糖粗品，苯酚硫酸法测多糖粗品产量，从而筛选出一株高产胞外多糖的菌株。该菌株为革兰氏阴性无芽孢杆菌，好气、有鞭毛。在营养琼脂及脱脂乳平板培养基上形成光滑、黏液状菌落且有明显突起，大多连成一片。该菌株16S rRNA基因序列在基因文库中的进入号为JX498970 (Genebank accessnumber JX498970)，根据其生理生化特性及16S rDNA序列分析的结果，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)鉴定为(Rhizobium radiobacter)SlO菌株,并进行了保藏，保藏号为CGMCC NO. 4524。
该菌株的微生物学特性如表I所示表I (Rhizobium radiobacter) SlO 菌株理化试验结果
权利要求
1.一株放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) S10,其特征在于,其保藏号为CGMCCNO. 4524。
2.ー种放射形根瘤菌的胞外多糖，其特征在干，所述的胞外多糖主要由半乳糖和葡萄糖组成，所述的半乳糖和葡萄糖的摩尔比为I. 00 4. 60 6. 40，所述胞外多糖的平均重量分子量在3. 5 X IO3 3. 8 X IO6道尔顿之间。
3.如权利要求2所述的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖由保藏号为CGMCCNO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) S 10菌株所产生；所述的胞外多糖中平均重量分子量在2. OX IO6 3. 8 X IO6道尔顿之间的胞外多糖占80 85%，平均重量分子量在3. 5X IO3 2. OXlO6道尔顿之间的胞外多糖占15 20%，以上百分比均指占总的胞外多糖的重量百分比。
4.ー种放射形根瘤菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤 1)将放射形根瘤菌于24 38°C下，在无菌培养基中发酵24 120小时得发酵液；其中，所述的无菌培养基为下列任ー种①固形物含量为3 12%(w/w)的脱脂乳，②3 12%(w/w)脱盐乳清和③常规的用于培养放射形根瘤菌的无菌合成培养基； 2)将步骤I)制得的发酵液在95 100°C加热10 30分钟，以灭活发酵液中使多糖发生降解的酶； 3)在经过步骤2)灭酶处理后的发酵液中加入三氯こ酸，使其终浓度达到4 10%(w/v)，静置8 16小时，尚心获得发酵上清液； 4)在步骤3)获得的上清液中加入2 4倍体积的体积百分数为80 100%的こ醇，离心或过滤收集沉淀物并将沉淀物溶于水，用截留分子量为10，000D的透析袋在水中透析48 72小时，每12 24小时换水一次，在温度不超过105°C下干燥或者真空冷冻干燥得胞外多糖粗品。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤I)中所述的放射形根瘤菌是保藏号为CGMCC NO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter)S10菌株；所述发酵中放射形根瘤菌的接种量为0. 5 8% (v/v)。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(I)为将保藏号为CGMCCNO. 4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter) SlO菌株于24 38°C下，在所述无菌培养基中发酵6 48小时，获得发酵种子液，再按0. 5 8% (v/v)的接种量接种于所述的无菌培养基发酵，得到发酵液。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，其在步骤4)之后还包括步骤5):将制得的胞外多糖粗品进行进一步的纯化，以去除蛋白和其它杂质；所述进ー步的纯化是采用三氯こ酸法去除蛋白和采用透析法去除其它杂质。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的三氯こ酸法为将胞外多糖粗品用5(T80°C蒸馏水溶解，使其浓度为0. 3 I. 5% (w/w)，待溶液冷却至15 25°C时加入三氯こ酸，使三氯こ酸的最终质量浓度为4 10%，在0 8°C放置过夜，离心或过滤去除沉淀物；所述的透析法为将去除沉淀后的胞外多糖溶液用截留分子量为10，000道尔顿的透析膜在0 8°C透析48 72小时。
9.ー种增稠组合物，其特征在于，其包括如权利要求2 3任一项所述胞外多糖、常规增稠剂辅料和生理学上可接受的载体。
10.如权利要求9所述增稠组合物或如权利要求2 3任一项所述胞外多糖在食品、医药和相关领域的应用。
全文摘要
本发明公开了一株新的放射形根瘤菌菌株和其所产生的胞外多糖，以及该胞外多糖的制备方法和应用。所述的菌株是保藏号为CGMCC NO.4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter)S10菌株；所述的胞外多糖主要由半乳糖和葡萄糖组成，其摩尔比为1.00︰4.60～6.40，该胞外多糖的平均重量分子量在3.5×103～3.8×106道尔顿之间。本发明所述放射形根瘤菌菌株的胞外多糖水溶性好，且在低浓度时具有很好的粘度、很好的表面活性、很好的蛋白质可混性以及极好的稳定性/乳化性。
文档编号C12N1/20GK102816724SQ20121032471
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者吴正钧, 周方方, 季红, 韩瑨, 游春苹, 艾连中, 陈卫 申请人:光明乳业股份有限公司