Lamp技术鉴别鱼翅真伪用的引物及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪用的引物，本发明还涉及一种采用上述 引物鉴别鱼翅真伪的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 鱼翅作为我国传统的海产珍品，被誉为"海味八珍"之一，属于高级滋补品，常与 燕窝、鲍鱼、海参等相提并论，它是鱼翅是鲨、鳐、鲛的鳍或尾端部分，经过一系列复杂的加 工过程精制而成，主要产于日本、墨西哥、巴西、非洲、中东、印度、南美洲及澳洲，我国的东 海、南海也有出产，但是我国是主要的进口国，每年进口约3500吨各种形式的鱼翅。
[0003] 藍鱼隶属于软骨鱼纲Chondri chthyes、板鲍亚纲Elasmobranchii、藍目 Selachoidei、星藍属Mustelus，是海洋生物链中最高层的重要鱼类，全世界共有藍鱼约 370种，可是用来割取鱼翅的约20来种，由于其珍贵且稀有，加上市场对它的需求持续的增 长，导致各类仿鱼翅、参假鱼翅等泛滥流行，极大地扰乱了我国市场次序，极大地侵害了消 费者的权益，甚至危害了消费者的身体健康。急需研宄灵敏度高且操作方便适合基层实验 室检测的方法来打击假冒伪劣鱼翅产品，以保护消费者的合法权益。
[0004] 目前国内外已有人报道用PCR和FINS方法来鉴定鱼翅的种类，但存在PCR扩增 片段过大难以扩增出来，还有设计的引物范围不宽，存在漏检的可能，而且PCR方法需要昂 贵仪器设备，操作复杂。目前制备鱼翅的主要鲨鱼种类包括有犁头沙KJ170949. l:Sphyrna lewini ;JX827259.1, Sphyrna lewini ;ΗΜ239662·1 Sphyrna lewini、平滑锤头藍 KM489157. I Sphyrna zygaena、公牛藍 KF646785. I Carcharhinus leucas、灰色真藍 KC470543. I Carcharhinus obscurus、黑翼藍 KJ720818. I Carcharhinus melanopterus、 白斑星藍 AB015962. I Mustelus manazo、欧氏尖吻藍 EU528659. I Mitsukurina owstoni、 海洋白鳍藍 AY820736. I Carcharhinus longimanus、褐星藍 EU099503. I Mustelus henlei、KJ010763.1 Mustelus henlei、沙虎藍 KF569943.1 Carcharias taurus、大青藍 ⑶324148.1 Prionace glauca、鼬鲨 KF111728.1 Galeocerdo cuvier、姥鲨 KF597303.1 Cetorhinus maximus、灰星藍 KF889325.1 Mustelus griseus 等藍鱼。
[0005] 目前已有的检测方法，其检测步骤繁琐，采用仪器昂贵，不能快速、方便的实现鉴 别鱼翅真伪。故此，现有鉴别鱼翅真伪的检测方法有待进一步完善。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种LAMP技术鉴别鱼翅 真伪用的引物；
[0007] 本发明另一个目的是提供一种采用上述引物鉴别鱼翅真伪的方法，该方法具有快 速、检测灵敏度高、操作简单、结果直接可以判读等特点。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
[0009] 一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪用的引物，其特征在于包括：
[0010] 正向外引物 F3 :5'-CAGGATTTCCTGATCAATG-3' ；
[0011] 反向外引物 B3 :5'-GTGTGAACTCAGATCACGT-3' ；
[0012] 正向内引物FIP :
[0013] 5'-AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC-AACCAAGTTACCCTAGGGATA-3' ；
[0014] 其中所述正向内引物FIP包含Flc和F2序列：
[0015] Flc ：AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC ；
[0016] F2 ：AACCAAGTTACCCTAGGGATA
[0017] 反向内引物BIP :
[0018] 5'-TACGGCCTCGATGTTGGATC-AGGACTGTTAATCGTTGAACAA-3 '
[0019] 所述反向内引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0020] Blc ：TACGGCCTCGATGTTGGATC ；
[0021] B2 :AGGACTGTTAATCGTTGAACAA〇
[0022] -种LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0023] A、鱼翅DNA的提取
[0024] 采用纳米磁珠提取鱼翅DNA ;
[0025] B、建立LAMP反应体系
[0026] 25 μ L的LAMP反应体系包括20 μ L预反应溶液和5 μ L DNA模板，其中20 μ L预反 应溶液，由以下组分组成：
[0027] 2 X反应缓冲液 12. 5μL
[0028] 引物 2-4队 荧光目视检测试剂 LOKL 酶溶液 1. 去离子水 补齐至20 μL ;
[0029] 所述引物的序列包括：
[0030] 正向外引物 F3 :5'-CAGGATTTCCTGATCAATG-3' ；
[0031] 反向外引物 B3 :5'-GTGTGAACTCAGATCACGT-3' ；
[0032] 正向内引物FIP :
[0033] 5'-AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC-AACCAAGTTACCCTAGGGATA-3' ；
[0034] 其中所述正向内引物FIP包含Flc和F2序列：
[0035] Flc ：AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC ；
[0036] F2 ：AACCAAGTTACCCTAGGGATA
[0037] 反向内引物BIP :
[0038] 5'-TACGGCCTCGATGTTGGATC-AGGACTGTTAATCGTTGAACAA-3'
[0039] 所述反向内引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0040] Blc ：TACGGCCTCGATGTTGGATC ；
[0041] B2 :AGGACTGTTAATCGTTGAACAA。
[0042] C、向Loopamp反应试管中分别加入上述预反应溶液各20 μ L ;
[0043] D、在预反应溶液中加入待检测的待检测样品DNA 5 μ L，使总量达到25 μ L ;
[0044] Ε、对照反应中，阴性对照反应使用普通鲤鱼DNA 5 μ L，空白对照反应使用去离子 水5 μ L，阳性对照使用鱼翅本身提取的DNA 5 μ L ;
[0045] F、用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心；
[0046] G、将混合物置于LAMP浊度仪的反应孔中，于60-70 °C恒温反应90min，最后 60-80°C下保温5min以结束反应；
[0047] H、采用LAMP浊度仪方法或荧光目测的方法检测检验结果。
[0048] 如上所述的一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于所述（正向外引物 F3+反向外引物B3):(正向内引物FIP+反向内引物BIP)的浓度比为1:2-1:10。
[0049] 如上所述的一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于所述的FIP和BIP各 1. 6 μ M，各 40pmol ;F3 和 B3 各 0· 2 μ M，各 5pmol 〇
[0050] 如上所述的一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于步骤A中所述的纳米 磁珠提取鱼翅DNA具体步骤：
[0051] 1)制样：将不同鱼翅样品用锉刀磨碎，取磨碎样品0. 1-0. 5g的鱼翅组织加入ImL 抽提缓冲液进行研磨制成样品；
[0052] 2)清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用CldH2O反复清洗纳米磁珠3次，在 磁铁的作用下吸去CldH 2O ;
[0053] 3)结合：加入100 μ L的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室 温下吸附；
[0054] 4)清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
[0055] 5)裂解：加入50 μ L CldH2O到PCR管中，用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95°C， IOmin ；
[0056] 6)取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为鱼翅DNA。
[0057] 如上所述的一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于所述的LAMP浊度仪 方法包括有实时浊度检测和/或终点度检测。
[0058] 如上所述的一种LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于所述荧光目测的方 法：
[0059] 使用紫外线照射装置从试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进 行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧 光，而判定为阴性。
[0060]本发明米用环介导等温扩增 loop - mediated isothermal amplification，简称 LAMP是一种新的核酸检测方法，其原理是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的 DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在1小时内能扩增 出IO9祀序列拷贝，扩增产物电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。 传统的PCR技术，PCR结束后，需要对PCR产物进行琼脂糖