专利名称：条石鲷性别连锁的微卫星标记及其遗传性别鉴定方法
技术领域：
本发明属于水产生物技术领域中的鱼类分子标记和遗传性别鉴定技术，是一种条石鲷性别连锁的微卫星标记及其遗传性别鉴定方法。
背景技术：
条石鲷隶属于S卢形目(Perciformes)、石鲷科(Oplegnathidae)、石鲷属(Oplegnathus)，自然分布于太平洋和印度洋沿岸，我国产于黄海、东海和台湾海峡，是一种暖温性海洋中下层鱼类。它生长速度快、肉质鲜美、抗病力强、色泽艳丽，具有较高的食用价值和观赏价值。 条石鲷的染色体核型分析发现，雄鱼的染色体数为47，核型为3m+44t，雌鱼的染色体数为48,核型为2m+46t ;雄鱼具有I条巨型的异型性染色体,没有其他染色体与之配对(徐冬冬等，水生生物学报，2012);性染色体的发现为开展条石鲷性别连锁标记的筛选奠定了基础。条石鲷第一次性成熟需要3 4年，性别连锁标记能够在幼苗时期准确辨别其性别特征，有利于在人工繁育及选择育种过程的雌雄筛选。同时，性别连锁标记也为确定性别决定主效区奠定基础。因此，开展条石鲷性别差异的分子标记或基因的研究，找到与性别连锁的分子标记或基因，将对条石鲷的性别控制及性别决定机制研究具有重要的理论价值与应用价值。目前，利用分子标记进行基因组扫描，已经筛选到了与一些经济鱼类的性别相关的分子标记。但是这些标记不具有通用性，仅能用于单一物种甚至单一品系的性别鉴定。在条石鲷性别相关标记筛选方面，利用AFLP技术已经筛选到4个与性别特异的分子标记，转化成SCAR标记后能够通过简便的PCR方法鉴定条石鲷的遗传性别(目前已经申请专利，专利号201110228374. 5)。但是，AFLP标记作为显性遗传的分子标记，无法区分纯合子和杂合子。到目前为止，可用于条石鲷性别鉴定的标记还非常缺乏。微卫星标记是由1-6个碱基组成的短串联重复序列，呈现共显性遗传的特点，能够区分纯合子和杂合子。因此，条石鲷微卫星连锁的性别标记筛选，不仅能够建立准备高效的遗传性别鉴定方法，还有助于条石鲷性别决定区地确定及性别差异基因的筛选研究。有关条石鲷性别连锁的微卫星标记及遗传性别检测技术，目前国内外均未见文献报道。
发明内容
针对现有技术中不易鉴定条石鲷幼鱼的缺陷，本发明提供了一种条石鲷性别连锁的微卫星标记及其遗传性别鉴定方法，为条石鲷的定向育种提供理论和技术上的指导。为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现本发明提供了一种条石鲷性别连锁的微卫星标记，所述雄性特异的微卫星标记Nibeal3的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示ACMT GTGAC TGTCC CTACT GTGTC TCTTC TTCTT TCAGC CTCTT TMTG CTCTC CTGTCTGTCT GTCTG TCTGT GTCTC CATTT CTCTC AGTAT CAAGC CGTTC TCTCA GTAAG CCTAC TCTGTGCAGA CAGCA GGGAC CACCA CAATC TCAGG TGAGA GGGAC CGCGA TACM TTATC TCCTTT CTGTAAAGCG AACAG GCGGT CTGCTC TCCTG CCATT TAG所述分子标记Nibeal3的引物序列如下SEQ ID NO 2 5/ -GTGTCTCTTCTTCTTTCAGCCTCT-3;SEQ ID NO 3 5/ -TGAGATTGTGGTGGTCCCTG-3'本发明还提供了一种条石鲷遗传性别鉴定方法，步骤如下I)提取条石觸的基因组DNA ;2)以条石鲷的基因组DNA为模板、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3为引物进行PCR扩增；
3)对步骤2得到的PCR产物在6%的变性聚丙烯酰胺上进行电泳，银染显带，扩增出A、B两个等位基因，扩增出A等位基因的一定为雄性个体。所述步骤2)的PCR扩增条件如下94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，共35个循环，最后72°C延伸 lOmin。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是本发明首次筛选到条石鲷性别性别连锁的微卫星标记，发现了雄性特异的等位基因，并针对该等位基因设计了特异引物，建立了基于微卫星技术的遗传性别鉴定方法。本发明所提供的遗传性别鉴定方法具有准确、灵敏、可靠等优点，不仅对鱼类性别机制研究具有重要的科学价值，而且为鱼类性别控制和选择育种具有重要的意义和应用价值。
图I是微卫星引物Nibeal3扩增的微卫星图谱。A、B为扩增的等位基因，I 9为雌性个体,10 18为雄性个体；等位基因A为雄性个体特有。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例I本发明包括两个方面一、条石鲷微卫星标记的筛选及其引物序列；二、基于微卫星标记的条石鲷遗传性别鉴定方法。一、条石鲷微卫星标记的筛选及其引物序列I、条石鲷的基因组DNA提取选取I尾条石鲷的鳍条约20mg，将其剪碎，然后加入350 μ L的组织裂解液，在裂解液中加入10%的十二烷基硫酸钠(SDS)40yL、蛋白酶KQOmg/mDSyL和核酸酶(20mg/mL)4l·! L，放在56°C的水浴锅中消化，一般需要消化2 3h ;取出离心管低速离心去除管壁水珠，然后加入300 μ L的6mol/L的NaCl溶液，震荡混匀，室温12000r/min离心20 30min，移上清夜至新的离心管中；在上清液中加入等体积的异丙醇(约700 μ L)，轻轻混匀，置于_20°C中2 3h，室温12000r/min离心15min，弃去上清液；加入70%的乙醇于离心管中，混匀漂洗沉淀一次，然后室温12000r/min离心lOmin，弃去上清液；室温下使乙醇挥发，自然干燥；用适当体积(30 50 μ L)的双蒸水或者TE缓冲液(ρΗ8. O)溶解DNA，将DNA保存在_20°C备用。基因组DNA的浓度应不低于50ng/l·! L，基因组DNA的纯度要求0D260/0D280 值为 I. 76 I. 80。2、条石鲷基因组文库构建取100 μ g基因组DNA，用限制性内切酶RsaI进行酶切，酶切产物在I %琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下250-1000bp的DNA片段，采用凝胶回收试剂盒纯化回收。将酶切片段与接头 Adaptorl (5，-GGCCACACCCCAAGCTTCG-3，)和 Adaptor2 (5，GATCCGAAGCTTGGGGTCTCGGCC-3’)在T4连接酶作用下16°C连接过夜。以Adaptorl为引物，以连接产物为模板进行PCR，50 μ L反应体系如下5 μ L连接产物，Adaptorl引物浓度O. 4 μ M，dNTP浓度为O. ImM,IXPCR buffer, MgCl2浓度为I. 5mM, Taq酶I. 25U，补充双蒸水至终体积50 μ L。PCR反应程序如下94°C预变性5min，94°C变性30S，60°C退火45s，72°C延伸60s，共35个循环，最后72°C延伸lOmin。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化回收。
3、磁珠富集将所制的纯化产物与生物素标记的寡核苷酸探针(CA)ltl进行杂交。将杂交液加入已平衡好的磁珠，室温放置30min。将离心管依次用洗涤缓冲液^XSSC,O. 1% SDS ；2X SSC, O. 1% SDS ；1XSSC,0. 1% SDS)于45°C洗涤两次，再用双蒸水室温洗一次。最后加双蒸水，在PCR仪上95°C变性15min，收集上清作为分离DNA模板。4、DNA片段的克隆测序割胶回收的目的DNA片段插入pGME-T载体后转化感受态大肠杆菌DH5 α。转化的细菌在37°C摇床培养Ih后涂布到IPTG(O. 06mg/mL)和X_gal (O. 04mg/mL)的氨苄青霉素(O. lmg/mL)LB平板上，37°C过夜培养。挑选单菌落到盛有500 μ L LB氨苄青霉素培养基的96孔培养板中，200rpm/min，37°C培养7h后，测序确定微卫星位点。5、微卫星引物的设计使用SSRHunter软件查找重复序列，并辅以人工校对。根据微卫星DNA侧翼序列，利用在线引物软件Primer 3设计引物。6、性别连锁的微卫星标记的筛选首先用条石鲷雌雄个体的基因组DNA各9个对每对微卫星进行扩增。微卫星扩增的PCR条件如下94°C预变性5min，94°C变性30s，55_60°C退火40s，72°C延伸40s，共35个循环，最后72°C延伸7min。扩增体系为25 μ L，包括50ng的基因组DNA，0. 4μ M上下游引物，dNTP 浓度为 O. ImM, I XPCR buffer, MgCl2 浓度为 I. 5mM, Taq 酶 I. 25U。将变性好的扩增产物用6%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；电泳条件电压1200V，功率50W，电流50mA，温度45°C，时间I. 5h。总共用了 20对微卫星引物对6个条石鲷雄性个体和6个条石鲷雌性个体的基因组DNA进行了扩增，然后对电泳后产生的DNA条带图谱进行观察，照相和分析，筛选出I个与性别连锁的微卫星标记Nibeal3，引物序列为SEQ ID NO 2和SEQ ID NO :3。二、基于微卫星标记的条石鲷遗传性别鉴定方法I、提取条石鲷鳍条的基因组DNA剪取20 30mg的条石鲷尾鳍，并将其剪碎，然后加入350 μ L的组织裂解液，在裂解液中加入10%的十二烷基硫酸钠(SDS)40yL、蛋白酶KQOmg/mDSyL和核酸酶(20mg/mL)4l·! L，放在56°C的水浴锅中消化，一般需要消化2 3h ;取出离心管低速离心去除管壁水珠，然后加入300 μ L的6mol/L的NaCl溶液，震荡混匀，室温12000r/min离心20 30min，移上清夜至新的离心管中；在上清液中加入等体积的异丙醇(约700 μ L)，轻轻混匀，置于_20°C中2 3h，室温12000r/min离心15min，弃去上清液；加入70%的乙醇于离心管中，混匀漂洗沉淀一次，然后室温12000r/min离心lOmin，弃去上清液；室温下使乙醇挥发，自然干燥；用适当容积(30 50 μ L)的双蒸水或者TE缓冲液(ρΗ8. O)溶解DNA，将DNA保存在_20°C备用。基因组DNA的浓度应不低于50ng/l·! 1，基因组DNA的纯度要求0D260/0D280 值为 I. 76 I. 80。2、性别连锁的微卫星标记验证利用步骤I提取的条石鲷基因组DNA为模板，以SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3为引物进行PCR扩增。PCR反应的体系为DNA模板lOOng，上下游引物浓度O. 4 μ M，dNTP浓度为O. ImM, I X PCRbuffer, MgCl2浓度为I. 5mM, Taq酶I. 25U，补充双蒸水至终体积25 μ L。PCR的反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，共35个循环，最后72°C延伸IOmin。扩增产物用6%的聚丙烯酰胺电泳检测，使用DL2000marker为 参照。电泳条件电压1200V，功率50W，电流50mA，温度45°C，时间I. 5h。仅出现等位基因A的为雄性个体。
权利要求
1.一种条石鲷性别连锁的微卫星标记，其特征在于所述雄性特异的微卫星标记Nibeal3的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.权利要求I所述分子标记Nibeal3的引物序列如下SEQ ID NO :2:5' -GTGTCTCTTCTTCTTTCAGCCTCT-3;SEQ ID NO 3 5/ -TGAGATTGTGGTGGTCCCTG-3'
3.一种条石鲷遗传性别鉴定方法，其特征在于，步骤如下 1)提取条石觸的基因组DNA；2)以条石鲷的基因组DNA为模板、SEQID NO :2和SEQ ID NO :3为引物进行PCR扩增； 3)对步骤2得到的PCR产物在6%的变性聚丙烯酰胺上进行电泳，银染显带，扩增出A、B两个等位基因，扩增出A等位基因的一定为雄性个体。
4.如权利要求书3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的PCR扩增条件如下 94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，共35个循环，最后72°C延伸IOmin0
全文摘要
本发明提供了一种条石鲷性别连锁的微卫星标记及遗传性别鉴定方法，属于基因工程技术领域。本发明公开了条石鲷雄性连锁的微卫星标记，核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，以及条石鲷性别连锁的微卫星标记的PCR引物，正义引物序列如SEQ ID NO2所示，反义引物序列如SEQ ID NO3所示。本发明首次筛选到条石鲷性别连锁的微卫星标记，建立条石鲷遗传性别的鉴定方法；所述遗传性别鉴定方法具有准确、灵敏、可靠等优点，不仅对鱼类性别机制研究具有重要的科学价值，而且为鱼类性别控制和选择育种具有重要的意义和应用价值。
文档编号C12Q1/68GK102899323SQ201210441669
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月8日 优先权日2012年11月8日
发明者徐冬冬, 楼宝, 李三磊, 孙鑫序, 辛俭, 耿智, 詹炜 申请人:浙江省海洋水产研究所