专利名称：一种从水稻种子生产和分离纯化重组人抗胰蛋白酶(OsrAAT)的方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻遗传密码子优化的OsrAAT基因、相关载体及其从转基因水稻种子生产、分离和纯化OsrAAT的方法。
背景技术：
·人α1-抗胰蛋白酶(AAT)，也称为人α 1_蛋白酶抑制剂(α 1-ΡΙ)，是人外周血中最富含丝氨酸的蛋白酶抑制剂。其主要是在肝脏中合成，并在肺中抑制中性粒细胞弹性蛋白酶(Blank、Brantly，1994)。AAT缺乏症是一种与肺气肿和肝脏疾病相关的遗传性疾病(Eriksson, 1996)。静脉注射增加源自血衆的人α1-抗胰蛋白酶(plasma-derived AAT,pAAT)是治疗AAT缺乏症病人唯一可行的临床治疗方法(Heresi和Stoller，2008)。此外，AAT还有许多的治疗用途，如在预防小鼠I型糖尿病、治疗皮肤病(Lewis，Shapiro等，2005 ；Brown, 2006)，并在先天免疫系统中发挥着重要的抗炎作用(许、戴等，2001)。目前，商业化生产的pAAT主要是来自人血浆，其产量受到血液供应的限制，而且人源PAAT具有传播新的或未知病原体的风险，因此确保其安全性显得非常复杂(Karnaukhova,Ophir等,2006)。除此之外，为了满足市场需求,生产重组al_抗胰蛋白酶(rAAT)并具有成本效益的替代方法也不断被开发出来。1983年，大肠杆菌首先被用于生产无活性的rAAT (Bollen等，1983)。之后用大肠杆菌表达系统表过rAAT的最高水平可达到38mg/L(Karnaukhova等,2004)。但是，由于大肠杆菌表达系统缺乏转录后的修饰作用，其表达的rAAT也只能用于实验室研究。作为真核表达系统的酵母可以进行高甘露糖类型的聚糖修饰作用(Cregg, Cereghino等,2000),但这种修饰与人聚糖结构不同。缺失和异常的糖基修饰是妨碍酵母表达系统表达重组多糖蛋白的主要问题。尽管通过分批补料培养酵母来大规模生产rAAT的收率高达到1. 23g/L (Tamer和Chisti，2001)，然而，药代动力学研究表明，酵母生产的rAAT会被迅速地从血液中清除(Casolaro，Fells等，1987)。也有研究用黑曲霉表达rAAT，因为其糖基化模式是更类似于哺乳动物(Maras，van Die等，1999 ；Gerngross 2004 ;Ward, Lin 等，2004 ;Nevalainen, Te' ο 等，2005)。然而，并没有研究这个系统中的聚糖修饰作用，而且50mg/L的表达水平是仍然很低。因此这个系统表达的rAAT也仅限于实验室研究。如小鼠、兔、山羊和绵羊等动物表达系统也成功地表达了 rAAT (Carlson, Rogers等，1989 ；Archibald, McClenaghan 等，1990 ；Massoud, Bischoff 等，1991 ； Wright, Carver等，1991 ；Carver, Wright 等，1992 ；Ziomek, 1998).也从绵羊奶(DalrympIe 和 Garner,1998)和山羊奶(Ziomek，1998)中获得大规模生产的rAAT。尽管从转基因绵羊奶中分离的rAAT纯度达99. 9%，然而在人类体内，痕量的天然绵羊AAT和α1-抗糜蛋白酶便可以诱导一种全身性抗体应答(Spencer, Humphries等,2005)。也有用植物表达系统生产rAAT,包括水稻细胞(Terashima,Murai等，1999)、转基因番爺(Agarwal, Singh等,2008)和叶绿体(Nadai, Bally等，2009)。其中，转基因番茄和叶绿体中rAAT的表达水平分别达到总蛋白质的1. 55%至2%。在水稻细胞中rAAT的产量达到200毫克/升。最近发现，谷物作物的胚乳细胞是很有潜力的可用于生产重组蛋白质的表达系统。水稻胚乳已被用来表达各种重组药物蛋白，如人乳铁蛋白(Suzuki, Kelleher等，2003)、人溶菌酶(Yang, Guo等,2003)、rhIGF-Ι融合和人粒细胞-巨噬细胞群激活因子(Ning, Xie等，2008 ；Xie, Qiu等，2008)。最近，水稻种子成功地应用于大规模生产的重组人血清白蛋白(He，Ning等，2011)。这些研究表明，水稻胚乳是具有成本效益和安全性的药物蛋白质表达平台。尽管使用不同的表达系统来表达rAAT已经取得了进步，然而大规模生产植物源重组人抗胰蛋白酶仍受到表达水平的限制。而且，至今未见有关使用水稻胚乳来大规模生产重组人抗胰蛋白酶的报道，也未见有关从水稻种子中分离纯化重组人抗胰蛋白酶方法的报道
发明内容
本发明的一个目的是提供一种水稻遗传密码子优化的重组人抗胰蛋白酶基因，以提高人抗胰蛋白酶基因在水稻种子的表达水平；本发明称0srAAT(0ryZasatiVa AAT)基因，具有如SEQ ID NO.1所示的序列。进一步地，本发明还提供了含有上述OsrAAT基因的载体，优选水稻胚乳细胞特异性表达载体，更优选具有如图3所示的结构的载体。本发明的另一个目的是提供上述载体在制备OsrAAT转基因水稻种子中的应用。本发明的另一个目的是提供一种制备OsrAAT转基因水稻种子的方法，包括以下步骤(I)制备具有如SEQ ID NO.1所示序列的OsrAAT基因； (2)构建水稻胚乳细胞特异性表达的OsrAAT表达载体和选择性标记基因载体；(3)将步骤2所获得载体共转化到水稻品种的愈伤再生组织中；(4)培养所述愈伤再生组织，经筛选和诱导获得OsrAAT转基因水稻植株；(5)培养OsrAAT转基因水稻植株，获得OsrAAT转因水稻种子。其中，所述OsrAAT表达载体优选具有如图3所示的结构。其中，所述选择性标记基因载体优选具有如图4所示的结构。本发明的再一个目的是提供一种从OsrAAT转基因水稻种子中分离纯化OsrAAT的方法，包括以下步骤(I)以OsrAAT转基因水稻种子为原料制备OsrAAT提取液；(2)以阴离子交换层析对OsrAAT提取液进行初级纯化，获得初级OsrAAT洗脱液，其中所述阴离子交换层析的介质为DEAE sepharose FF;(3)以阳离子交换结合金属螯合的复合层析对初级OsrAAT洗脱液进行中级纯化，获得中级OsrAAT洗脱液,其中所述复合层析的介质为MacroprepCHT-1 ；(4)以阴离子交换结合疏水作用的复合层析对中级OsrAAT洗脱液进行末级纯化，获得纯化的OsrAAT,其中所述复合层析的介质为Capto Adhere。进一步地，上述方法包括以下步骤(I)以OsrAAT转基因水稻种子为原料，将稻谷脱壳成半精米并研磨成80-100目的米粉，将所述米粉与提取缓冲液以重量(kg)/体积(L)为1: 5-1 10的比例混合，常温下提取I小时后将得到的混合物经滤布式板框压滤机压滤，得到澄清的OsrAAT提取液；其中所述提取缓冲液的成分为20-25mM磷酸盐缓冲液、l-4mM巯基乙醇，pH6. 9-7.1 ；(2)采用DEAE sepharose FF填料的层析柱进行初级分离纯化,采用8_12个柱体积的PH为6. 9-7.1的20-25mM磷酸盐缓冲液，以100-180cm/h的流速平衡柱子；以步骤I的OsrAAT提取液作为上样样品，其中样品电导为2-3. 5ms/cm, pH为6. 80-7. O.;用pH为6. 8-7.1的IOO-1lOmMPB缓冲液以100_180cm/h的流速洗脱样品，收集含有OsrAAT的洗脱液，获得初级OsrAAT洗脱液；(3)采用Macroprep CHT-1层析柱进行次级纯化分离，采用8-12个柱体积的pH为6. 9-7. 2的5-12mM磷酸盐缓冲液以100_150cm/h的流速平衡柱子，以稀释四倍的步骤2中的初级OsrAAT洗脱液为上样样品，其中样品电导为2-3. 5mS/cm，pH为6. 8-7. O ;用pH为
6.8-7.1的IOO-1lOmMPB缓冲液以100_180cm/h的流速洗脱样品，收集含有OsrAAT的洗脱液，获得中级OsrAAT洗脱液； (4)采用Capto Adhere层析进行精纯，用8-12倍柱体积的pH为7. 5-8. 2的8_12mM磷酸盐缓冲液以100-180cm/h的流速平衡柱子，以中级OsrAAT洗脱液为上样样品，其中样品电导为 2-3. 5ms/cm, pH 为 6. 8-7.1 ;用 pH 为 6. 6-7. O 的 46mMPB, 400mMNaCl 缓冲液以100-180cm/h的流速洗脱样品，收集含有OsrAAT的洗脱液，获得纯化的OsrAAT。进一步地,上述分离纯化OsrAAT的方法包括以下步骤(I)以OsrAAT转基因水稻种子为原料，将稻谷脱壳成半精米并研磨成80-100目的米粉，将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为Ikg IOL的比例混合，常温下提取I小时后将得到的混合物经滤布式板框压滤机压滤，得到澄清的迦rAAT提取液；其中所述提取缓冲液的成分为20mM磷酸盐缓冲液、ImM巯基乙醇，pH7. O ；(2M^2OmUtJDEAE sepharose FF 填料装于 Econo-column 15/20 层析柱上，用200ml pH为7. O的20mM磷酸盐缓冲液，以150cm/h的流速平衡柱子；以OsrAAT提取液作为上样样品，其中样品电导为2. 6ms/cm，pH为6. 95 ;用pH为7. O的108mMPB缓冲液以150cm/h的流速洗脱样品，收集含有OsrAAT的洗脱液，获得初级OsrAAT洗脱液；(3)将 20ml 的 Macroprep CHT-1 填料装于 Econo-column 15/20 层析柱上，用200ml pH为7. O的IOmM磷酸盐缓冲液以150cm/h的流速平衡柱子，以稀释四倍的步骤2中初级OsrAAT洗脱液为上样样品，其中样品电导为3. 0ms/cm, pH为6. 90 ;用pH为7. O的108mMPB缓冲液以150cm/h的流速洗脱样品，收集含有OsrAAT的洗脱液，获得中级OsrAAT洗脱液；(4)将 IOml 的 Capto Adhere 装于 Econo-column 15/20 层析柱上，用 200mlpH 为
8.O的IOmM磷酸盐缓冲液以150cm/h的流速平衡柱子，以中级OsrAAT洗脱液为上样样品，其中样品电导为3. 0ms/cm，pH为6. 90 ;用pH为6. 8的46mMPB，400mMNaCl缓冲液以150cm/h的流速洗脱样品，收集含有OsrAAT的洗脱液，获得纯化的OsrAAT。
图1是质粒p0sPMP02的结构示意图。图2是质粒p0sPMP131的结构示意图。图3是质粒p0sPMP132的结构示意图。
图4是质粒p0sPMP135的结构示意图。图5是Western杂交结果。显示9株不同的转基因水稻表达的OsrAAT均聚集在其胚乳细胞中。图6是Southern杂交结果图。其中，分别用EcoR1、HindIII以及同时用EcoRI和HindIII进行酶切。图7显示了不同植株中OsrAAT的表达水平。图8是以阴离子交换层析作为初级纯化，用不同填料进行层析的电泳图谱；其中，图8A 为 DEAE sepharose FF 填料，图 8B 为 Macroprep DEAE 填料，图 8C 为Capto Q填料；M :分子标记,S :上样样品,FT :穿透峰,Elu OsrAAT洗脱峰，Elul :杂质洗脱·峰，Elu2 =OsrAAT洗脱峰，CIP :在位清洗。图9是以复合填料作为初级纯化,用Macroprep CHT-1层析时的电泳图谱；其中，M :分子标记，S :上样样品，FT :穿透峰，Elu =OsrAAT洗脱峰，CIP :在位清洗。图10是以疏水层析作为中级纯化，用不同填料进行层析时的电泳图谱；其中图1OA 为 Phenyl sepharose HP 填料，图1OB 为 Phenyl sepharose FF HS 填料，图1OC为Octyl sepharose FF填料；M :分子标记,S :上样样品,FT :穿透峰,Elu OsrAAT洗脱峰，CIP :在位清洗。图11是以复合填料作为中级纯化，用不同填料进行层析时的电泳图谱；其中，图1lA 为 Macropr印 CHT-1 填料，图1lB 为 Capto MMC 填料，图1lC 为 CaptoAdhere ；M :分子标记,S :上样样品,FT :穿透峰,Elu :OsrAAT洗脱峰,Elul :杂质洗脱峰，Elu2 =OsrAAT洗脱峰，CIP :在位清洗。图12是以复合填料作为末级纯化，用Capto Adhere层析时的电泳图谱；其中，M :分子标记，S :上样样品，FT :穿透峰，Elu =OsrAAT洗脱峰，CIP :在位清洗。图13是以亲和填料作为末级纯化，用不同填料进行层析是的电泳图谱；其中，图13A 为 AAT-select 填料，图 13B 为 ConA sepharose 6B 填料;M :分子标记，S :上样样品,FT :穿透峰,Elu OsrAAT洗脱峰，clean 图14是含有rAAT的粗体液依次经过阴离子交换层析、阳离子结合金属螯合作用层析、阴离子结合疏水作用层析进行纯化的电泳图谱；其中使用的填料从左到右依次为DEAE sepharose FF、Macroprep CHT-J^PCaptoAdhere ；M :分子标记，S :上样样品，FT :穿透峰，Elu OsrAAT洗脱峰。图15是纯化后获得的OsrAAT的HPLC纯度图谱(HPLC-SEC)。图16是对OsrAAT生物活性的分析结果；其中，左图是条带转移的SDS-PAGE分析结果，右图是Western杂交结果；M :分子标记，1: 132-17T1代植株的OsrAAT，2 :人血浆AAT，3 :添加了猪弹性蛋白酶的OsrAAT，4 :添加了猪弹性蛋白酶的人血浆AAT，5 :水稻中华11的提取物。图17是OsrAAT的猪弹性蛋白酶抑制活性的测定结果。
具体实施例方式以下通过结合附图详细说明本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
以下实施例中使用的Macroprep CHT-1填料,生产商是伯乐(BIO-RAD)公司；DEAEFast Flow、Macroprep-DEAE、Capto Q、Phenyl sepharose HP、Phenylsepahrose FF HS、Octyl sepharose FF>Capto MMC>Capto Adhere>MT~seIect> ConA sepharose 6B填料，生产商是通用电气(GE Healthcare)公司；Econo_columnl5/20层析柱,购自伯乐(BIO-RAD)公司；XK16/20层析柱，购自通用电气(GE Healthcare)公司；其他实施材料和试剂除特别说明之处均为普通市售。实施例1水稻特异性表达重组人抗胰蛋白酶载体的构建及转基因水稻植株的获得人AAT基因(Genbank登记号NM001002235)，由Heron Blue生物技术公司根据水稻偏好的遗传密码子合成，将46. 5%的人α1-抗胰蛋白酶(AAT)遗传密码子进行优化并使18. 1%的人α1-抗胰蛋白酶核苷酸发生改变，具体如SEQID NO.1所示，但是其相应的氨基酸序列没有变化；本实施例选用水稻特异性启动子Gtl3a及其信号肽来介导重组人抗胰蛋白酶基因在水稻胚乳细胞中的表达，具体参考
发明者杨代常, 施倩妮, 张莉平 申请人:武汉禾元生物科技有限公司