专利名称：用scar技术鉴定水稻繁殖不育系纯度的方法
技术领域：
本发明涉及水稻育种技术领域，特别是涉及一种用SCAR技术鉴定水稻繁殖不育系纯度的方法。
背景技术：
种子纯度一直是影响杂交水稻种子生产的重要因素，不育系繁殖的亲本纯度直接关系到杂交水稻种子的生产。在制种时，保持系如果混入不育系中，将严重影响种子的质量。因此，建立一种快速、有效、简便的种子纯度鉴定方法是育种者一直关注的焦点问题之一。在生产上，种子纯度实际上包含两个方面杂交种子纯度和繁殖种子纯度，杂交种子纯度指生产上所用的杂交稻种子纯度，而繁殖种子纯度一般是指用于制种的不育系的纯度。常规的不育系纯度检验方法是于冬天在海南大田种植，第二年春天于穗期显微镜检测花粉育性或套袋自交检测其结实率来确定不育系的纯度，不仅费工、费时，而且受环境和人为因素的影响，难以及时提供准确、可靠的数据报告。分子标记技术因直接作用于DNA，不仅快速、准确，而且不受环境和人为因素的影响，广泛应用于品种纯度的鉴定。近年来，在杂交稻种子的分子生物学纯度鉴定上已开展了许多研究，并已有用分子标记技术鉴定杂交稻种纯度的报道，它们一般是基于核DNA的差异进行的。到目前为止，尚未见有关不育系种子纯度鉴定的方法报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用SCAR技术鉴定水稻繁殖不育系纯度的方法。
对于繁殖种子的纯度鉴定，其难度要大于杂交种子。由于水稻不育系和保持系的同核性，使二者除育性差异外，形态上很难分辩。因此，它们的分子鉴定必须建立在线粒体DNA或叶绿体DNA上，目前已有一些报道在不育系与保持系的线粒体DNA上找到多处能区分不育系和保持系的位点，但大多未进行实际的验证。由于叶绿体DNA具有高度的保守性，其间存在的差异可能更具有普遍性，因而更适于纯度的鉴定。本发明申请人曾采用AFLP技术在多对水稻细胞质雄性不育系及其保持系之间找到了一个共同的差异位点，并提出了利用不育系与保持系叶绿体DNA的差异性对繁殖不育系种子纯度进行分子鉴定的思路。
本发明依次通过下列步骤实现
(1)利用不育系与保持系二者的叶绿体碱基序列差异，设计序列如下的三个专一PCR引物P15′-aggaacgcggtaggtggggg-3′P25′-agaaaaagaaaatggggatatggcg-3′P35′-ggtgcagagactcaatggaa-3′(2)提取鉴定材料的DNA；(3)用上述设计的引物P1、P2、P3对DNA进行PCR扩增；(4)用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳；(5)用快速银染法进行染色；(6)根据电泳和染色结果即可区分不育系和保持系，达到纯度鉴定的目的。
上述方法中引物设计、DNA的提取、PCR扩增、凝胶电泳、快速银染法进行染色等均为公知技术。
本发明的优点是基于DNA水平的鉴定，不受环境和材料部位的影响，速度快，不必经过一个生长季节；利用不育系与保持系在叶绿体上的差异而进行，结果更可靠。
具体实施例方式实施例1取生产上大面积使用的不育系II-32A 300株，分别提取其DNA，利用所设计的三个专一引物P15′-aggaacgcggtaggtggggg-3′P25′-agaaaaagaaaatggggatatggcg-3′P35′-ggtgcagagactcaatggaa-3′对DNA进行PCR扩增，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用快速银染法进行染色，根据电泳和染色结果区分出不育系和保持系，鉴定出纯度。同时，采用单株花粉育性镜检和套袋自交为对照检测，结果PCR分子检测结果与两种对照完全一致，说明该方法是可靠的。
实施例2取本发明申请人选育的新型不育系缙2A 300株，分别提取其DNA，利用所设计的三个专一引物P15′-aggaacgcggtaggtggggg-3′P25′-agaaaaagaaaatggggatatggcg-3′
P35′-ggtgcagagactcaatggaa-3′对DNA进行PCR扩增，用聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用快速银染法进行染色，根据电泳和染色结果区分出不育系和保持系，鉴定出纯度。同时，采用单株花粉育性镜检和套袋自交为对照检测，结果PCR分子检测结果与两种对照完全一致，说明该方法是可靠的。
权利要求
1.一种用SCAR技术鉴定水稻繁殖不育系纯度的方法，其特征在于依次通过下列步骤实现(1)利用不育系与保持系二者的叶绿体碱基序列差异，设计序列如下的三个专一PCR引物P15′-aggaacgcggtaggtggggg-3′P25′-agaaaaagaaaatggggatatggcg-3′P35′-ggtgcagagactcaatggaa-3′(2)提取鉴定材料的DNA；(3)用上述设计的引物P1、P2、P3对DNA进行PCR扩增；(4)用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳；(5)用快速银染法进行染色；(6)根据电泳和染色结果即可区分不育系和保持系，达到纯度鉴定的目的。
全文摘要
一种用SCAR技术鉴定水稻繁殖不育系纯度的方法，通过对供检材料进行DNA的提取、引物设计、PCR扩增、凝胶电泳、快速银染法进行染色等步骤，区分不育系和保持系，达到从而鉴定不育系纯度的目的。该方法是基于DNA水平的鉴定，不受环境和材料部位的影响，速度快，不必经过一个生长季节；利用不育系与保持系在叶绿体上的差异而进行，结果更可靠。
文档编号C12Q1/68GK1546687SQ20031011557
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月3日 优先权日2003年12月3日
发明者何光华, 桑贤春, 侯磊, 裴炎, 杨正林, 张毅, 李云峰 申请人:西南农业大学