专利名称：一种快速检测全基因组范围多基因变化的芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测全基因组范围多基因变化的芯片，即单拷贝序列标志位点合并基因芯片，以及所述芯片用于检测全基因组范围内基因变化，特别是多基因变化的用途。
背景技术：
DNA的异常变化包括分子水平的点突变、缺失、基因重排和细胞水平的各种染色体畸变。目前已知，人体复杂疾病如绝大部分肿瘤、高血压、糖尿病等等，一般都涉及多个基因的改变。而且，由于个体差异，相同疾病在不同患者的所涉及的基因变化并不一定完全相同。因此，复杂疾病的分子诊断应该尽可能同时检测患者存在的全部基因改变。
比较基因组杂交技术(CGH)是一种能够对整个基因组的DNA拷贝数改变进行检测的方法[Kallioniemi et al.，1994]。但是，这种方法是染色体水平的，无法检测小于1Mb的改变。Vysis公司最近开发了由BAC[Bacterial Artificial Chromosome]和PAC[P1 BacterophageArtificial Chromosome]组成的微阵列，但是这些BAC和PAC均至少几百kb。显然，目前现有技术均无法实现全基因组范围内的多基因改变的快速检查。
为解决现有技术中存在的上述问题，本发明人成功地开发一种快速检测全基因组范围多基因变化的芯片，该芯片基于不含重复序列的UniSTS和已知的功能基因而设计，定名为单拷贝序列标志位点(UniSTS)合并基因芯片，能实现全基因组范围内多基因变化的快速检测。
发明内容
序列标志位点(STS，sequence tagged sites)是一大类染色体DNA位标，有些STS属于基因内的序列，有些来自非基因序列，有些STS是两个或几个核苷酸以不同次数重复的多态性序列(如微卫星DNA)。
本发明的一个方面，涉及一种用于快速检测待测样品中全基因组范围内多基因变化的芯片，即单拷贝序列标志位点合并基因芯片，所述芯片由不含重复序列、在基因组中呈单拷贝的UniSTS和在基因组中呈单拷贝的功能基因的序列作为探针、以及适于制备DNA芯片的固相载体而组成，其中去除与所述功能基因序列在基因组中它处有同源的序列。
在本发明所述单拷贝UniSTS合并基因芯片中，所选探针可根据正常基因组中存在的单拷贝序列加以确定，从而使得在与样品杂交时不存在同源序列的干扰，所得结果是目的探针特异的。对本领域技术人员而言，正常基因组中的单拷贝序列能够从GenBank数据库中很方便地获得。
而一旦确定所选的探针序列，从所述基因组序列中筛查与所选的的探针序列的同源序列的方法、以及将所筛查的同源序列删除的方法均为本领域技术人员所熟知。
适于制备本发明所述DNA芯片的固相载体为本领域技术人员知晓的那些，包括但不限于载玻片、硅化玻璃、聚丙乙烯、聚丙烯、交联树脂、改性滤纸、等。实际上，能够使用任意形式的载体，只要不影响待测样品与探针的杂交反应。
采用本发明所述单拷贝序列标志位点合并基因芯片，由于芯片上的探针均属于基因组中的单拷贝序列，在与待测样品杂交时，不仅不存在同源序列的干扰，所得结果是目的探针特异的，而且也不受重复序列的影响。这对获得正确的杂交结果尤为重要。
采取本发明所述单拷贝序列标志位点合并基因芯片，其效果明显优于目前使用最多的cDNA芯片杂交方法，即使不用Cot-1 DNA封闭，也不会产生太强的背景。目前现有芯片在与待测样品杂交时之所以用Cot-1 DNA封闭，是因为芯片上的探针序列和用于杂交的样品序列中，均含有许多重复序列。
另一方面，鉴于诸如肿瘤、高血压、糖尿病等复杂疾病的发生虽然在分子水平上涉及多基因变化，然而发生变化的基因或基因组DNA序列常常仅仅占所属BAC或PAC序列的一部分。因此使用常规BAC或PAC制备的芯片时，发生病变基因或基因组DNA序列的杂交信号将会不同程度地被BAC或PAC中非病变序列的杂交背景所遮盖。采用单拷贝UniSTS合并基因芯片则完全克服了BAC或PAC芯片的这种缺陷，能够获得特异而且灵敏的检测结果。
更为重要的是，由于诸如肿瘤、高血压、糖尿病等复杂疾病中改变的DNA序列并不一定全部属于表达的功能基因序列。因此，采用仅含有已知基因的常规芯片检测时，会漏检反映疾病变化的非表达序列中存在的改变，特别是在功能基因表达中起重要作用的调控序列中出现的改变。单拷贝UniSTS合并基因芯片可以检测基因及非表达序列的变化。在本发明中，所述基因变化包括但不限于DNA分子水平的点突变、替换、插入、缺失、基因重排、基因扩增或基因缺失，还应当包括任何待测样品中涉及复杂疾病的其他形式的多基因改变。
本发明的另一方面还包括所述单拷贝序列标志位点合并基因芯片用于检测待测样品中全基因组范围多基因变化的用途，例如，本发明所述芯片可用于待测样品中基因扩增的检测，和/或用于基因缺失的检测。通过本发明所述芯片对待测样品中基因的扩增和缺失的检测，能够用于疾病诊断，包括鉴别诊断；疾病的预后判断；用于疾病相关基因的基础研究和临床研究；以及用于疾病易感性的预警，以便及时预防疾病的发生；以及用于疾病治疗监测，以判断治疗的效果。
实施例实施例一单拷贝序列标志位点合并基因芯片制备方法一可以采用如下方法步骤制备本发明所述单拷贝序列标志位点合并基因芯片
1)从GenBank中[NCBI-MapViewer]获得目的染色体区域范围内不含重复序列的UniSTS位点；2)通过同源查询[NCBI-Blast]去除在基因组中与其它序列有同源(即部分同源)的UniSTS位点，获得最终选定的UniSTS位点；3)从GenBank中获得目的染色体区域范围内已知的功能基因，通过同源查询[NCBI-Blast]去除基因DNA序列中与基因组其它序列有同源(即部分同源)的部分，获得功能基因DNA中的单拷贝序列，并为扩增这些单拷贝序列设计引物；4)用功能基因DNA中的单拷贝序列的引物和UniSTS位点的引物(GenBank中均已提供)进行PCR；5)用PCR产物点样于常规的固相载体介质如载玻片上(每个探针重复点样三次)，即制备成芯片。
实施例二单拷贝序列标志位点合并基因芯片制备方法二可以采用如下方法步骤制备本发明所述单拷贝序列标志位点合并基因芯片1)从GenBank中获得目的染色体区域范围内的功能基因和不含重复序列的UniSTS位点；2)对每个功能基因和UniSTS按照常规方法设计寡核苷酸探针；3)采用类似于实施例1所述的方法，对设计的寡核苷酸探针进行同源查询，去除在基因组中与其它序列有同源(即部分同源)的寡核苷酸序列，获得最终选定的寡核苷酸探针；4)在载玻片上进行原位合成选定的寡核苷酸探针(每个探针在连续三个位点重复合成)，即制备成芯片。
实施例三单拷贝序列标志位点合并基因芯片与待测样品的杂交与结果判断单拷贝序列标志位点合并基因芯片与待测样品的杂交与结果判断的方法步骤如下
1)被测DNA的荧光标记、芯片杂交以及杂交信号的检测，均按照一般芯片杂交的方法[例如Lu et al.，2001]进行；2)对检测到的扩增和缺失的UniSTS位点，进行GenBank查询，即可获知何者属于已知基因，或位于何种已知基因附近。
实施例四利用单拷贝序列标志位点合并基因芯片检测食管癌患者样本中的基因变化利用本发明所述单拷贝序列标志位点合并基因芯片检测食管癌患者样本中的基因变化，具体方法如下1)根据文献报道(Wei et al.，2002)，食管癌3q和11q13存在高频率的扩增，鉴此选取以下UniSTS，并按照实施例一的方法制备芯片SHGC-84720，RH65804，RH103798，RH47977，SHGC-141861，SHGC-77558，SHGC-77561，SHGC-8728，SHGC-77567，SHGC-77564，RH94147，WI-14081，SHGC-53491，RH91810，STS-L07077，RH46594，RH41895，G16564，G57075，G31473，G61027，G16688，G56307，G58794，G60692，G23521，G16578，Beta-肌动蛋白(作为内参照)；2)根据分子克隆实验指南中描述的方法，提取待测食管癌组织标本的DNA和任何正常的DNA(正常人外周血DNA或正常胎盘DNA，也可以购买商售正常DNA产品)，其中正常DNA用作参照DNA；3)根据Lu et al.等人，2001，的方法，用Cy3和Cy5分别标记步骤2)中所制备的食管癌标本DNA和正常DNA各1微克；4)将步骤3)中所标记的两种DNA等比例混合，与制备的UniSTS芯片杂交；5)根据Lu et al.等人，2001，的方法进行洗涤和信号检测。其中，标记Cy3和Cy5分别发绿色和红色荧光，因而强绿色信号指示肿瘤基因扩增，强红色信号指示肿瘤基因缺失。如果显示绿、红较均等的混合色信号，则表明肿瘤样品中该基因没有异常变化。
在本实施例中，利用如上述所制备的芯片检测结果显示RH47977，SHGC-77558，SHGC-8728，SHGC-77567，SHGC-77564，WI-14081，SHGC-53491，STS-L07077，G31473，G60692在相当比例的食管癌中有高频率的扩增。
查询GenBank发现，这些UniSTS分别位于LOC254827，IRA1，KCNMB2，KCNMB2，ANC_2H01，SOX2，ATP11B，EHHADH，FAD104，LOC254827基因内部或附近。
上述检测结果表明，采用本发明所述单拷贝序列标志位点合并基因芯片，能够在一次检测中同时反映出位于待测样品全基因组中多个不同基因发生的改变，有利于在分子水平上进行疾病的诊断、预后判断和治疗监测。
参考文献Kallioniemi OP，Kallioniemi A，Piper J，Isola J，Waldman FM，Gray JW，Pinkel D.Genes Chromosomes Cancer.1994；10(4)231-43.
Lu J，Liu Z，Xiong M，Wang Q，Wang X，Yang G，Zhao L，Qiu Z，Zhou C，Wu M.Int JCancer.2001；91(3)288-94.
Wei F，Ni J，Wu SS，Liu H，Xu X，Han YL，Cai Y，Zhang JW，Chen XJ，Pang H，Lu N，Ji L，Wu M，Wang MR.Cancer Genet Cytogenet，2002 Oct1；138(1)38-43.
本工作受国家高技术研究发展计划基金(2001AA221151)、国家科技攻关计划基金(2002BA711A06)、国家杰出青年科学基金(30125026)、国家重点基础研究发展规划基金(G1998051205，2002CB513101)和教育部高等学校博士学科点基金(20010023016)资助。
权利要求
1.一种单拷贝序列标志位点合并基因芯片，所述芯片由不含重复序列、在基因组中呈单拷贝的序列标志位点和在基因组中呈单拷贝的功能基因的序列作为探针，以及适于制备DNA芯片的固相载体而组成。
2.权利要求1所述的芯片，其中序列标志位点选自样品正常基因组中存在的一个或多个单拷贝序列，功能基因选自样品正常基因组中呈单拷贝的一个或多个功能基因。
3.一种单拷贝序列标志位点合并基因芯片的制备方法，其包括如下步骤方法A1)从GenBank中获得目的染色体区域范围内不含重复序列的UniSTS位点；2)通过同源查询去除在基因组中与其它序列有同源(即部分同源)的UniSTS位点，获得最终选定的UniSTS位点；3)从GenBank中获得目的染色体区域范围内已知的功能基因，通过同源查询去除基因DNA序列中与基因组其它序列有同源(即部分同源)的部分，获得功能基因DNA中的单拷贝序列，并为扩增这些单拷贝序列设计引物；4)用功能基因DNA中的单拷贝序列的引物和UniSTS位点的引物(GenBank中均已提供)进行PCR；5)用PCR产物点样(每个探针重复点样三次)，即制备成芯片；或者方法B1)从GenBank中获得目的染色体区域范围内的功能基因和不含重复序列的UniSTS位点；2)对每个功能基因和UniSTS按照常规方法设计寡核苷酸探针；3)对设计的寡核苷酸探针进行同源查询，去除在基因组中与其它序列有同源(即部分同源)的寡核苷酸序列，获得最终选定的寡核苷酸探针；4)在载玻片上进行原位合成选定的寡核苷酸探针(每个探针在连续三个位点重复合成)，即制备成芯片。
4.权利要求1所述芯片用于检测待测样品中全基因组范围内多基因变化的用途。
5.权利要求4所述的用途，其中所述基因变化包括DNA分子水平的点突变、替换、插入、缺失、基因重排、扩增或缺失。
全文摘要
本发明涉及一种快速检测全基因组范围多基因变化的芯片，即单拷贝序列标志位点合并基因芯片，以及所述芯片用于检测全基因组范围内基因变化，特别是多基因变化的用途。
文档编号C12Q1/68GK1618984SQ200310115360
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月21日 优先权日2003年11月21日
发明者王明荣, 徐昕, 蔡岩, 韩亚玲, 吴旻 申请人:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所