专利名称：检测全基因组CpG岛的寡核苷酸芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因检测芯片，尤其涉及一种检测全基因组CpG岛的寡核 苷酸芯片及其应用。
背景技术：
正常细胞功能的发挥与细胞本身的遗传信息、遗传调控和表观遗传调 控相关，随着人类基因组计划的实施，国内外对基因组所携带的遗传信息 在疾病发生、发展中的重要作用已有比较深入的研究。相对而言，染色质 所携带的表观遗传信息在疾病发生、发展中的重要作用才刚开始被认识， 表观遗传学基因组正在兴起。表观遗传学的过程包括DNA甲基化，组蛋白 的修饰和ATP依赖的染色质的修饰，都可以引起基因表达的改变。其中 DNA的甲基化是目前的一个研究热点。
疾病发生、发展是细胞内遗传本身、遗传调控和表观遗传调控的紊乱。 大量的临床和基础研究结果表明除了遗传因素，环境因素在大多数疾病发 生、发展中有巨大的影响，而表观遗传调控机制在遗传因素和环境因素的 互动关系中起了桥梁的作用，已有的研究结果表明表观遗传因素的作用占 百分之七十左右。近年的研究更进一步指出表观遗传调控机制在多种疾病 发生中起主导作用。基因表达的表观遗传调控是保证细胞内基因的时空正
确表达所必需的。因此，当表观遗传调控出现异常时，在胚胎发育阶段可 能引起各种先天性的发育缺陷，在成体阶段可能造成各种疾病的发生。后
基因组时代表观遗传学的兴起为解开生命奥秘及征服疾病带来了希望。
在哺乳类动物中，胞嘧啶的甲基化是惟一己知的DNA内源性修饰方 式，即通过DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase, Dnmt)的催化作 用，将甲基基团加在胞嘧啶的5' C位置处。在哺乳类动物细胞中，大多 数5'-甲基胞嘧啶(5mC)以双核苷酸CpG的形式出现。CpG双核苷酸在 基因组中的分布很不均匀，其中密度较高的区域称为CpG岛(CpGisland)。 以人类基因组为例，人类5(m 6(m的基因有CpG岛，据估计整个基因组 有45, 000个CpG岛，并且几乎总是位于基因启动子和(或)外显子周围。 除了印记基因和女性失活的X染色体的几个基因外，正常情况下，在CpG 岛的CpGs总是非甲基化的，而大多数CpG岛之外的CpGs则是甲基化的。
DNA甲基化的机制及其作用尚未完全清楚，目前认为它与控制基因表 达、DNA修复、外源基因的识别和剔除、以及染色体的稳定性等相关。已 证实，CpG岛的甲基化可以直接导致相关基因的表观遗传学沉默，启动子 区域CpG岛甲基化是与基因突变和缺失相并列的抑癌基因失活的第3种途 径，并成为近年来肿瘤研究的热点之-。
随着生物技术的进步，DNA甲基化的检测手段日渐丰富，常用技术 的基本原理主要可以归纳为四个方面:一种是依赖化学物质对甲基化和非 甲基化胞嘧啶的化学活性不同，将甲基修饰基团的差别转变为碱基序列的 不同，从而加以分离；另一种是依赖甲基化和非甲基化胞嘧啶对特定的限
制性内切酶处理的不同反应而实现；第三种是依据差异性杂交的原理；第
四种则是依靠甲基化CpG结合(methyl-CpG-binding domain, MBD)蛋白 家族对甲基化以及非甲基化的CpG序列的结合能力的不同进行分离。此
外，还有单核苷酸法、甲基化接受力的检测法等多种技术，这些技术极大 地促进了表观遗传学的研究，推动了表观基因组学研究的开展。目前虽然
已经存在较多的DNA甲基化的检测技术，但是每种方法都有一定的局限
性，难以达到大规模和全基因组范围的分析，也不能检测全基因组中甲基
化或非甲基化DNA具体的CpG位点。现有的表观基因组学急需要高通量， 大规模的研究手段，全面地了解在疾病的发生过程中甲基化谱式的改变。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测全基因组CpG岛的寡核苷 酸芯片，能够高通量、大规模地对全基因组DNA进行CpG岛的检测。为此， 本发明还提供应用该寡核苷酸芯片进行检测的方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现
在本发明的一个方面，提供了一种检测全基因组CpG岛的寡核苷酸芯 片，包括固相载体和探针，所述探针与全基因组中CpG岛及CpG岛上下游 2kb区域的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。
所述探针的设计针对包括人类、大鼠、小鼠在内的哺乳动物全基因组 CpG岛及CpG岛上下游2kb区域的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种应用上述寡核苷酸芯片检测全基因 组CpG岛位置的方法，包括如下步骤
(1) 抽提待测样品核酸；
(2) 对步骤(1)抽提的DNA进行纯化；
(3) 标记步骤(2)纯化的DNA;
(4) 选取上述寡核苷酸芯片，在适于与所选芯片进行杂交的条件下，加入经标记的DNA，并使其反应足够时间；
(5)检测杂交反应结果，以确定待测样品DNA的CpG岛位置。
其中，所述步骤(2)中，DNA经纯化后，可按不同的研究目的进行 富集，并经片段化处理；所述步骤(3)的标记包括荧光素标记、生物 素标记、荧光共振能量转移标记、放射性元素标记和酶标记。
本发明的检测全基因组CpG岛的寡核苷酸芯片，能高通量、快速、准 确地在全基因组范围内检测目的DNA所在的CpG岛位置，有助于全面了解 全基因组CpG岛区域的甲基化谱式的改变。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。 附图是应用本发明的寡核苷酸芯片检测全基因组CpG岛的方法的流 程图。
具体实施例方式
本发明的针对全基因组CpG岛的寡核苷酸芯片，包括固相载体和探 针，所述固相载体选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材 料中的一种或它们的任意组合；所述探针与全基因组范围内CpG岛及CpG 岛上下游2kb区域的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。
应用本发明的寡核苷酸芯片检测人全基因组CpG岛的方法如附图所 示，具体步骤为
(1)寡核苷酸芯片的制备 l)探针设计
针对全基因组范围内的CpG岛及CpG岛上下游2kb区域的核苷酸序列
设计探针，平均每个CpG岛设计6 10条探针，用于确定所检测DNA所在 的CpG岛的位置。设计探针长度为30 bp 55bp， Tm值65。C 7(TC， GC 含量为50 60%。 2)芯片制备
采用原位合成的方式进行。 (2)待测样品的处理和标记
1) 全基因组DNA抽提及目的基因的获取
采用FlexiGene DNA Kit (250) (QIAGEN， Cat. No. 51206) i式剂盒 抽提待测样品基因组DNA。将抽提溶解好的DNA移入高压灭菌过的1. 5ml 离心管中，取lul进行电泳(1%琼脂糖凝胶，0.5XTBE, EB， 80MV， 1.5 小时电泳)，在FR-200紫外与可见分析装置上拍摄照片，并对照marker (Lambda DNA/EcoRI+Hindlll)进行定量。抽提的DNA依据不同的研究需 要可做进一步的筛选和富集。
2) 目的DNA的纯化和片段化
目的DNA采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)纯化。纯化的DNA经测定浓度后，用DNase I进行片段化，片断 化长度控制在80 200bp左右。片段化的反应体系包括IX DNase I缓冲液，200 ngM纯化目的DNA， DNase I (0. 0012 ,g)。反应条件 为37。C温浴5 min，然后95°C 15 min。片段化后的产物跑1. 5%琼脂糖 凝胶，电泳检测结果。
3) 荧光素标记
利用脱氧核苷酸末端转移酶在3'末端进行荧光素标记，标记的反应
体系包括
片段化目的DNA 25 W
5X脱氧核苷酸末端转移酶缓冲液 8 KL 40 W体系^ Cy3-dCTP (1 rnM) 1 W
脱氧核苷酸末端转移酶(20 U/Hl)3 W 、ddH20 3 W
反应条件为37X:温浴120min，然后95。C加热15min。 (3)芯片杂交及结果分析
以荧光标记为例，标记的DNA 95C变性10 min，立即置于冰上，用 于杂交。杂交反应体系包括IOXSSPE， 0.01% triton， 5XDenhard， s solution, 10% DMSO以及荧光素标记的DNA。反应条件为45。C 65。C温 浴1小时 16小时。然后相继用洗漆缓冲液I (2XSSC， 0.2% SDS)和 洗涤缓冲液II (1XSSC， 0.1% SDS)在45。C 65X:各洗涤10 min，室温 下用洗涤缓冲液III (0. 1XSSC)洗涤5分钟，最后在室温下用cWH20洗涤 30秒。洗涤后的芯片，经甩干后，用Axon 4000A芯片扫描仪进行扫描(也 可以用其他的激光扫描仪)。扫描结果用GenePix 4000A软件处理图像得 到数据文件，然后对数据文件进行分析。
对寡核苷酸芯片的杂交结果进行分析，以确定目的DNA所在的CpG岛位置。 实施例1
应用本发明的寡核苷酸芯片检测人全基因组CpG岛的方法如附图所 示，具体步骤为
l.寡核苷酸芯片的制备
1) 探针设计
针对人类全基因组范围内46， 957个CpG岛及CpG岛上下游2kb区域 的核苷酸序列，设计共设计367， 802条探针，平均每个CpG岛设计8条探 针，用于确定所检测DNA所在的CpG岛的位置。设计探针长度为30bp 55bp， Tm值65。C 70。C， GC含量为50 60%。
2) 芯片的制备采用原位合成的方式进行。 2.待测样品的处理和标记
1) 人基因组DNA抽提及目的基因的获取
采用FlexiGene DNA Kit (250) (QIAGEN， Cat. No. 51206)试剂盒 抽提人外周血或组织中基因组DNA。将抽提溶解好的認A移入高压灭菌过 的1.5ml离心管中，取lul进行电泳(1%琼脂糖凝胶，0.5XTBE, EB， 80MV， 1.5小时电泳)，在FR-200紫外与可见分析装置上拍摄照片，并对 照marker (Lambda DNA/EcoRI+HindIII)进行定量。抽提的DNA依据研 究需要分别使用甲基化和非甲基化特异的DNA亲和层析柱进行分离富集。
2) 目的DNA的纯化和片段化
分离的甲基化和非甲基化修饰的DNA分别采用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)进行纯化。纯it的DNA 经测定浓度后，用DNase I进行片段化，片断化长度控制在S0 150bp左 右。3(￥1片段化的反应体系包括IX DNaseI缓冲液，200 ng/W纯化 目的DNA， DNase I (0. 0012 U/Pg)。反应条件为37。C温浴5 min，然后95 °C 15 min。片段化后的产物跑1.5%琼脂糖凝胶，电泳检测结果。
3) 荧光素标记
利用脱氧核苷酸末端转移酶在3'末端进行荧光素标记，标记的反应 体系包括
片段化目的DNA 25 W
5X脱氧核苷酸末端转移酶缓冲液 8 W 40 rt体系^ Cy3-dCTP (1 mM) 1 W
脱氧核苷酸末端转移酶(20 U/W) 3 W 、ddH20 3 W
反应条件为37'C温浴120min，然后95"加热15min。 (3)芯片杂交及结果分析
标记的DNA经95。C变性10min,立即置于冰上，用于杂交。杂交反 应体系包括10XSSPE，0.01%triton，5XDenhard， s solution,腦DMS0 以及荧光素标记的DNA。反应条件为48。C温浴12小时。然后相继洗涤缓 冲液I (2XSSC， 0.2% SDS)和洗涤缓冲液II (1XSSC， 0.1% SDS)在 48。C各洗涤10 min，室温下用洗涤缓冲液III (0. 1XSSC)洗涤5分钟， 最后在室温下用ddH20洗涤30秒。洗涤后的芯片，经甩干后，用Axon 4000A 芯片扫描仪进行扫描。扫描结果用GenePix 4000A软件处理图像得到数据 文件，然后对数据文件进行分析。
对寡核苷酸芯片的杂交结果进行分析，以确定甲基化和非甲基化DNA 所在的CpG岛位置。
权利要求
1. 一种检测全基因组CpG岛的寡核苷酸芯片，包括固相载体和探针，其特征在于，所述探针与全基因组中CpG岛及CpG岛上下游2kb区域的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。
2. 如权利要求1所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的探针长度 为30 bp 55bp， Tm值为65。C 70。C， GC含量为50 60%，且每个CpG 岛设计6 10条探针。
3. 如权利要求1所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述探针的设计 针对包括人类、大鼠、小鼠在内的哺乳动物的全基因组CpG岛及其上下游 2kb区域的核苷酸序列。
4. 如权利要求1所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述固相载体选 材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的 任意组合。
5. —种应用权利要求1所述寡核苷酸芯片检测全基因组CpG岛的方 法，其特征在于，包括如下步骤(1) 抽提待测样品核酸；(2) 对步骤(1)抽提的DNA进行纯化；(3) 标记步骤(2)纯化的DNA;(4) 选取权利要求1所述的寡核苷酸芯片，在适于与所选芯片进行杂 交的条件下，加入经标记的DNA，并使其反应足够时间；(5) 检测杂交反应结果，以确定待测样品DNA的CpG岛位置。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，DNA经纯化后，可按不同的研究目的进行富集，并经片段化处理。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的标记包括荧光素标记、生物素标记、荧光共振能量转移标记、放射性元素标记和酶标记。
全文摘要
本发明涉及基因芯片，公开了一种检测全基因组CpG岛的寡核苷酸芯片，包括固相载体和探针，所述探针与全基因组中CpG岛及CpG岛上下游2kb区域的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。本发明还公开了一种应用上述寡核苷酸芯片检测全基因组CpG岛位置的方法。本发明的寡核苷酸芯片，能高通量、快速、准确地在全基因组范围内进行甲基化和/或非甲基化DNA的CpG岛检测，为全基因组CpG岛的相关研究提供有力工具。
文档编号C12Q1/68GK101205559SQ20061014747
公开日2008年6月25日 申请日期2006年12月19日 优先权日2006年12月19日
发明者颖 秦, 肖华胜 申请人:上海生物芯片有限公司