专利名称：一种微生物(sgm－1)及其制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种微生物及其制备方法。
背景技术：
植物寄生性线虫对农林业生产的为害极大，全球每年因此而造成的损失达数百亿美元，在我国仅黑龙江省每年因大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)为害造成损失近10亿元人民币。菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一重要的植物病原真菌，可侵染多种农作物、果树、蔬菜和经济作物，特别是造成油菜、大豆、向日葵、花生、芹菜和黄瓜等作物产量和品质的严重损失。对这两类病害的防治目前尚无经济可行的办法，生物防治可能是重要途径之一。
捕食线虫丝孢菌是植物寄生线虫的重要天敌，在自然条件下对线虫的群体数量具重要的调控作用。迄今已报道的捕食线虫丝孢菌计有6属，分别是节丛孢属(Arthrobotrys)、隔指孢属(Dactylella)、单顶孢属(Monacrosporium)、毒虫霉属(Nematoctonus)、三叉孢属(Tridentaria)和三角粽孢属(Triposorina)，其中又以前三属数量最多、分布最广和经济上最为重要。捕食线虫被认为是捕食线虫真菌在自然界中的重要生存方式之一。然而，Tzean & Estey(1978)发现在培养条件下捕食线虫真菌A.oligospora、A.robusta和A.superba在平板上除能以粘性菌网捕食植物寄生线虫外，也可以通过形成菌环寄生于Matruchotia varians、Rhizoctonia solani和Geotrichum sp.等真菌上，并在光学和电子显微镜下观察到这些真菌可以降解寄主真菌的细胞壁。虽然这一捕食线虫丝孢菌的菌寄生现象已被发现二十余年，但仅有的少量研究也都仅限于在平板上和灭菌土中进行。我们在对我国核盘菌的重寄生真菌资源的调查中发现许多捕食线虫真菌在自然土壤中可以寄生于菌核上，进一步的接种试验确认了这些捕食线虫真菌的菌寄生和捕食线虫的特性。这一研究结果丰富了土壤真菌生态学的内容，并为研制可以同时防治线虫病和菌核病的多功能生防菌剂提供了思路。
发明内容
本发明的目的是针对线虫病和菌核病，而提供一种从土壤中筛选培养出特定的拮抗性微生物来同时防治这两种病害，本发明还提供了该微生物的制备方法。
植物病害的生物防治，就是利用拮抗性微生物来防治植物的病害。为了有效地分离筛选到能对上述病害有抑制作用的生防菌株，本发明采取了菌核诱捕法，通过用菌核本身作诱饵筛选到两栖单顶孢(M.janus)SGM-1，该菌种已在中国专利局指定的保藏单位(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)保藏，其保藏登记号为CGMCC No.1036。
SGM-1菌株具有下述性质培养特征
在PDA上25℃光照培养7天后，菌丝体发达，絮状，白色，菌落直径约80mm，产水溶性色素，呈橙红色。在CMA上25℃光照培养5天后，气生菌丝不发达，菌落直径约65mm，不产色素。
镜检形态分生孢子梗分生孢子梗直立、单生，无分枝，梗长150-260μm，由基部向顶端渐细，基部宽约6μm左右，顶部约2μm左右。
分生孢子分生孢子拟陀螺状，长20～35μm，1-2个分隔。远轴端细胞特大，球形，直径约20μm左右；基部细胞呈倒三角形，与梗连接处平截。
该菌捕食线虫器官为三维粘性菌网；具厚垣孢子，间生，球形。
上述微生物的土壤分离方法是采集根际土样，加入菌核(50粒/100克土样)并混匀，25℃恒温诱捕寄生菌；4周后取出，经自来水漂洗、1％NaClO表面灭菌1分钟和无菌水充分漂洗后，置于放置在培养皿内的滤纸片上，25℃保湿培养2周后，在体视镜下检查菌核表面的重寄生菌，挑单孢至PDA平板培养，纯化分离获得。
上述微生物对核盘菌菌核表现较强寄生能力两栖单顶孢菌株SGM-1长满培养皿后，放入表面消毒过的菌核。22-25℃下共培养2周后，取出菌核，用1％NaClO表面消毒1分钟，再用无菌水漂洗3次后，放置于培养皿内的滤纸片上，22-25℃下保湿培养10天后，体视镜下观察到50％的菌核表面长出SGM-1菌株的孢子。
上述微生物对线虫表现较强寄生能力菌株SGM-1孢子液铺于CMA培养基平板上，22-25℃下培养24小时使孢子萌发。然后往平板上接入线虫(H.glycines)，5天后显微镜下检测到近100％的线虫停止活动。
上述微生物的液体发酵及菌剂制备方法，其特征在于该生产方法按以下步骤进行1)试管培养基采用固体马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，将两栖单顶孢SGM-1菌株接种在试管培养基上，22-25℃下培养72-96小时；2)扩大培养基采用液体培养基，以蔗糖和大豆蛋白胨分别作为碳、氮源(C/N为5∶1-15∶1)，其它组分及用量同查彼(Czapek)培养基，另加入0.05-0.2％(W/V)的天冬酰胺和1-5ppm硫胺。121℃高压湿热灭菌30分钟，待灭菌培养液冷却至室温时，将试管中两栖单顶孢SGM-1菌株接种在锥形瓶中，置于摇床上22-25℃振荡黑暗培养72-96小时作为种子液；3)液体发酵培养基以蔗糖和大豆蛋白胨分别作为碳、氮源(C/N为5∶1-15∶1)，其它组分及用量同查彼(Czapek)培养基，另加入0.05-0.2％(W/V)的天冬酰胺和1-5ppm硫胺，121℃高压湿热灭菌30分钟，待灭菌培养液冷却至室温时，将锥形瓶中的培养物按5-10％的比例接入发酵液，22-25℃振荡黑暗培养96-120小时得到相应拮抗菌的菌浆。
4)菌剂的制备硅藻土121℃高压湿热灭菌30分钟，晾干2-3天。将液体发酵获得的菌浆与硅藻土按1∶1-2∶1(V/W)混匀，晾干即得到相应拮抗菌的菌剂。
采用本发明制成的拮抗性微生物杀菌剂可用来同时防治菌核病和线虫病。另外，这一微生物可以产生几丁质酶、葡聚糖酶及纤维素酶等多种酶类，大大促进了土壤中植物残体的分解，有效地提高了土壤中的营养成分和有机质含量，降低了化肥、农药的用量，减轻了对环境的污染，为实现可持续农业的发展提供了可能。
实施例采集根际土样，加入菌核(50粒/100克土样)并混匀，25℃恒温诱捕寄生菌；4周后取出，经自来水漂洗、1％NaClO表面灭菌1分钟和无菌水充分漂洗后，置于放置在培养皿内的滤纸片上，25℃保湿培养2周后，在体视镜下检查菌核表面的重寄生菌，挑单孢至PDA平板培养，纯化分离获得。
上述微生物对核盘菌菌核表现较强寄生能力两栖单顶孢菌株SGM-1长满培养皿后，放入表面消毒过的菌核。25℃下共培养2周后，取出菌核，用1％NaClO表面消毒1分钟，再用无菌水漂洗3次后，放置于培养皿内的滤纸片上，25℃下保湿培养10天后，体视镜下观察到50％的菌核表面长出SGM-1菌株的孢子。
上述微生物对线虫表现较强寄生能力菌株SGM-1孢子液铺于CMA培养基平板上，25℃下培养24小时使孢子萌发。然后往平板上接入线虫(H.glycines)，5天后显微镜下检测到近100％的线虫停止活动。
上述微生物的液体发酵及菌剂制备方法，其特征在于该生产方法按以下步骤进行1)试管培养基采用固体马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，将两栖单顶孢SGM-1菌株接种在试管培养基上，25℃下培养96小时；2)扩大培养基采用液体培养基，以蔗糖和大豆蛋白胨分别作为碳、氮源(C/N为10∶1)其它组分及用量同查彼(Czapek)培养基，另加入0.15％(W/V)的天冬酰胺和4ppm硫胺。121℃高压湿热灭菌30分钟，待灭菌培养液冷却至室温时，将试管中两栖单顶孢SGM-1菌株接种在锥形瓶中，置于摇床上25℃振荡黑暗培养96小时作为种子液；3)液体发酵培养基以蔗糖和大豆蛋白胨分别作为碳、氮源(C/N为10∶1)，其它组分及用量同查彼(Czapek)培养基，另加入0.15％(W/V)的天冬酰胺和4ppm硫胺。121℃高压湿热灭菌30分钟，待灭菌培养液冷却至室温时，将锥形瓶中的培养物按10％的比例接入发酵液，25℃振荡黑暗培养96小时得到相应拮抗菌的菌浆。
4)菌剂的制备硅藻土121℃高压湿热灭菌30分钟，晾干3天。将液体发酵获得的菌浆与硅藻土按1∶1(V/W)混匀，晾干即得到相应拮抗菌的菌剂。
采用本发明制成的拮抗性微生物杀菌剂可用来同时防治菌核病和线虫病。另外，这一微生物可以产生几丁质酶、葡聚糖酶及纤维素酶等多种酶类，大大促进了土壤中植物残体的分解，有效地提高了土壤中的营养成分和有机质含量，降低了化肥、农药的用量，减轻了对环境的污染，为实现可持续农业的发展提供了可能。
权利要求
1.一种微生物，其特征在于它是用于植物核盘菌和线虫病害生物防治的两栖单顶孢(Monacrosporium janus)SGM-1菌株，其保藏编号为CGMCC No.1036。
2.按权利要求1所述的微生物的分离方法，其特征在于上述两栖单顶孢菌株SGM-1按以下方法分离培养获得采集根际土样，加入菌核并混匀，25℃恒温诱捕寄生菌；4周后取出，经自来水漂洗、1％NaClO表面灭菌1分钟和无菌水充分漂洗后，置于放置在培养皿内的滤纸片上，25℃保湿培养2周后，在体视镜下检查菌核表面的重寄生菌，挑单孢至PDA平板培养，纯化分离获得。
3.按权利要求1或2所述的微生物的液体发酵及菌剂制备方法，其特征在于该生产方法按以下步骤进行1)试管培养基采用固体马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，将两栖单顶孢SGM-1菌株接种在试管培养基上，22-25℃下培养72-96小时；2)扩大培养基采用液体培养基，以蔗糖和大豆蛋白胨分别作为碳、氮源(C/N为5∶1-15∶1)，其它组分及用量同查彼(Czapek)培养基，另加入0.05-0.2％(W/V)的天冬酰胺和1-5ppm硫胺。121℃高压湿热灭菌30分钟，待灭菌培养液冷却至室温时，将试管中两栖单顶孢SGM-1菌株接种在锥形瓶中，置于摇床上22-25℃振荡黑暗培养72-96小时作为种子液；3)液体发酵培养基以蔗糖和大豆蛋白胨分别作为碳、氮源(C/N为5∶1-15∶1)，其它组分及用量同查彼(Czapek)培养基，另加入0.05-0.2％(W/V)的天冬酰胺和1-5ppm硫胺，121℃高压湿热灭菌30分钟，待灭菌培养液冷却至室温时，将锥形瓶中的培养物按5-10％的比例接入发酵液，22-25℃振荡黑暗培养96-120小时得到相应拮抗菌的菌浆；4)菌剂的制备硅藻土121℃高压湿热灭菌30分钟，晾干2-3天。将液体发酵获得的菌浆与硅藻土按1∶1-2∶1(V/W)混匀，晾干即得到相应拮抗菌的菌剂。
全文摘要
本发明是一种微生物及其制备方法。其特征在于它是用于植物核盘菌和线虫病害生物防治的两栖单顶孢(Monacrosporium janus)菌株SGM－1，其保藏编号为CGMCC No.1036。上述菌株对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌核表现较强寄生能力，其平板回接菌核2周能寄生50％的菌核。上述菌株对线虫(Heterodera glycines)亦表现较强寄生能力，平板条件下5天内捕食近100％的线虫。采用本发明的拮抗性微生物接种，经过扩大培养基、液体发酵培养基制备得到相应的的菌浆，与灭菌硅藻土载体混匀而制成一种用于植物核盘菌和线虫病害生物防治的菌剂。
文档编号C12N1/14GK1621510SQ200310115190
公开日2005年6月1日 申请日期2003年11月26日 优先权日2003年11月26日
发明者李世东, 张拥华, 刘杏忠, 缪作清, 郭荣君 申请人:中国农业科学院生物防治研究所