专利名称：一种适于水稻品种真实性鉴定的issr指纹图谱构建方法
技术领域：
本发明涉及种质资源品种真实性鉴定技术，是一种适于水稻品种真实性鉴定的 ISSR指纹图谱构建方法。
背景技术：
水稻是重要的粮食作物，我国是世界上最大的杂交水稻种子生产国和消费国，具 有庞大的杂交水稻种子市场。水稻种子的真实性和纯度是衡量种子质量的重要指标，直接 影响农作物的产量、品质和农民的利益。生产上如何快速、准确、简便、经济地鉴定杂交水稻 种子真实性是一个突出的问题。传统的形态鉴定法依赖于品种表型差异，而形态性状的表 现受环境影响较大，且形态鉴定法工作量大、鉴定周期长、成本高、受季节限制，对种子营销 工作造成不利影响。同工酶和种子贮藏蛋白多态性不够丰富，且同工酶有组织和器官特异 性、稳定性差。分子标记技术具有多态性好、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，已开始广泛应 用于作物品种鉴定与纯度检测中。目前，应用较多的是SSR、RAPD、RFLP和AFLP等分子标 记。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)即简单序列重复间扩增，是由加拿大蒙特利尔 大学Zietkiewicz等于1994年创建的一种分子标记技术，其基本原理就是在SSR的3’或 5’端锚定1-4个碱基作引物，对两侧具有反向排列SSR的一段序列进行扩增，而不是扩增 SSR本身。锚定碱基避免了 SSR在基因组上的滑动，因而大大提高了 PCR扩增的稳定性和 可重复性。ISSR分子标记技术兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点，与SSR相比， ISSR不需要预先获知序列信息而使成本降低，且多态性更丰富；与RAPD相比，ISSR重复性 高，稳定性好，同时具备RAPD的简便、易操作等特点；与RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、成本 较低、DNA用量小、安全性较高。目前，ISSR标记技术在植物种质资源收集和鉴定、遗传多 样性和亲缘关系、基因定位、遗传图谱构建及分子标记辅助选择等研究中已有广泛的应用。 在水稻中，应用ISSR分子标记分析杂交水稻的遗传多样性已见有报道(王金花等，2005 ；黄 光文等，2006 ；陈兆贵等，2009)，但应用ISSR分子标记技术进行水稻品种真实性鉴定的DNA 指纹图谱构建方法尚未见报道。常规的DNA指纹图谱构建方法大都选择多条引物扩增谱带中有代表性的部分条 带，以“0” “1”矩阵来构建品种或种质资源的指纹图谱，不适于生产上农作物品种真实性简 便、快速分子标记鉴定。本发明以单一引物的扩增谱带构建指纹图谱表，并引入带型编号和 扩增谱带位点编号信息，是一种开放性的，可以随品种数目增加和更新换代而不断扩充和 更新的，由一系列若干个指纹图谱表构成的DNA指纹图谱构建方法。该方法使品种鉴定过 程中DNA指纹图谱检索更简便快速，更适合在农业生产中推广应用。本发明研究利用ISSR分子标记成功构建水稻品种的ISSR指纹图谱，为ISSR分子 标记技术更广泛地用于农业生产中水稻品种真实性鉴定打下良好的基础。该方法不仅适合 于水稻品种真实性的ISSR分子标记鉴定中DNA指纹图谱的构建，也适合于其他农作物和其 他分子标记的指纹图谱构建。
发明内容
本发明的目的是为了推进DNA分子标记技术在农业生产过程中作物种子真实性 鉴定上的广泛应用与推广，提供一种鉴定操作简便快捷、重复性和稳定性较好的适于水稻 品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法。适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法包括DNA提取、ISSR-PCR扩 增及电泳检测、DNA指纹图谱构建等内容。具体包括以下步骤(I)DNA 提取以不同水稻品种种子为材料，于苗期取幼嫩叶片采用改进的CTAB法提取DNA，取 部分DNA溶液测其浓度，稀释至20ng/ μ L，于-20°C保存备用； (2) ISSR-PCR扩增及电泳检测采用25 μ L反应体系，Mg2+浓度为2. 5mmol/L,引物浓度为0. 2 μ mol/L, dNTPs的 浓度为0. 2mmol/L, DNA用量为40ng，Taq DNA聚合酶的用量为IU ；PCR扩增程序条件为94°C预变性5min，94°C变性45s，50-56°C退火45s，72°C延伸 90s, 40个循环；最后72°C延伸10min，4°C保存；用1. 5%琼脂糖凝胶电泳，Gel-Red染色，检测ISSR-PCR扩增产物，在紫外灯下拍眧.
/、、、 (3) DNA指纹图谱构建根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱以水稻品种编号和扩增谱带带型为 纵列，以每条谱带的位点编号为横行，在每一纵横交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增 谱带用“0”表示，分别制得每条引物对不同品种的DNA指纹图谱表，以24个水稻品种为例， 引物UBC 815对24个水稻品种构建的指纹图谱表为多态性条带编号
权利要求
一种适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法，该方法包括DNA提取、ISSR PCR扩增及电泳检测、DNA指纹图谱构建等内容。具体包括以下步骤(1)DNA提取以不同水稻品种种子为材料，于苗期取幼嫩叶片采用改进的CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液测其浓度，稀释至20ng/μL，于 20℃保存备用；(2)ISSR PCR扩增及电泳检测采用25μL反应体系，Mg2+浓度为2.5mmol/L，引物浓度为0.2μmol/L，dNTPs的浓度为0.2mmol/L，DNA用量为40ng，Taq DNA聚合酶的用量为1U；PCR扩增程序条件为94℃预变性5min，94℃变性45s，50 56℃退火45s，72℃延伸90s，40个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；用1.5％琼脂糖凝胶电泳，Gel Red染色，检测ISSR PCR扩增产物，在紫外灯下拍照；(3)DNA指纹图谱构建根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱以水稻品种编号和扩增谱带带型为纵列，以每条谱带的位点编号为横行，在每一纵横交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示，分别制得每条引物对不同品种的DNA指纹图谱表，以24个水稻品种为例，引物UBC 815对24个水稻品种构建的指纹图谱表为引物UBC 900对24个水稻品种构建的指纹图谱表为(4)利用构建的DNA指纹图谱进行品种真实性鉴定将待鉴定的水稻品种样品在上述条件下所建立的指纹图谱与已构建的DNA指纹图谱相比较，与所建DNA指纹图谱不同的即为假种子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述ISSR-PCR扩增中采用的引物是UBC 815 和 UBC 900。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述DNA指纹图谱是以水稻品种编号、扩 增谱带带型编号、每条谱带位点编号及“1” “0”阵列为基本信息，便于检索和鉴定。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于每个DNA指纹图谱表是以单条ISSR引物 的扩增谱带信息构建的。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于DNA指纹图谱中，每个水稻品种都有其特异的DNA指纹，能将供试品种逐个鉴别开来。
全文摘要
本发明公开了一种适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法，提供一种快速、准确的水稻品种的ISSR指纹图谱构建方法及其应用。该方法包括以下步骤用改进的CTAB法提取水稻幼苗DNA；以幼苗DNA为模板进行ISSR-PCR扩增；对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并在紫外光下拍照；构建水稻品种的DNA指纹图谱，用于水稻品种真实性鉴定。本发明DNA指纹图谱是以水稻品种编号、扩增谱带带型、每条谱带的位点编号及“0”“1”阵列为基本信息，该方法具有操作简单、直观实用等特点，可以促进ISSR分子标记技术在准确、快速、简便的水稻品种真实性鉴定中更广泛地应用。
文档编号C12Q1/68GK101956016SQ20101050450
公开日2011年1月26日 申请日期2010年10月12日 优先权日2010年10月12日
发明者关亚静, 朱岩芳, 祝水金, 胡晋 申请人:浙江大学