专利名称：一种鉴定瓠瓜类型砧木品种真实性的方法
技术领域：
本发明属于生物领域，特别涉及甬砧系列瓠瓜类型砧木品种‘甬砧I号’、‘甬砧3号’、‘甬站4号’和‘甬站5号’真实性的一种鉴定方法。
背景技术：
西瓜枯萎病引发连作障碍，在瓜类种植区普遍发生，是瓜类生产的重大难题。据统计，每年西瓜枯萎病的发病率可达10-30%，严重地块甚至绝产，造成巨大经济损失。目前，由于土地资源限制和枯萎病病原菌的顽固性，轮作和化学防治效果不佳，且存在环境污染和食品安全等问题，因此，嫁接是西瓜生产中用以克服连作障碍和枯萎病的有效手段。甬砧系列是宁波市农业科学研究院重点针对西瓜嫁接栽培，自主育成的一系列瓠瓜类型砧木品种。它主要包括甬砧I号(早熟栽培西瓜嫁接专用砧木)、甬砧3号(长季节 栽培西瓜嫁接专用砧木)、甬砧4号(耐温度逆境西瓜嫁接专用砧木)，和甬砧5号(小果型西瓜嫁接专用砧木)。该系列抗性强、嫁接性能好、对西瓜品质无不良影响、产量高，瓜农增益明显。随着甬砧系列的推广，鉴别品种真实性对维护生产者和育种者的利益日益重要。然而，目前砧木品种的鉴定多运用种子或植株形态学鉴定等常规方法。这些方法耗时长、易受环境影响、可靠性差，面对品种繁多、外观表型相似、而遗传基础相对狭窄的砧木材料，鉴定真伪难以奏效。石占木新品种‘甬石占I号，、‘甬石占3号，、‘甬石占4号’和‘甬石占5号’至今只作了大田形态学纯度鉴定，尚缺乏便捷有效的品种真实性鉴定方法，对于品种保护还远远不够。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种利用DNA指纹图谱鉴定甬砧系列瓠瓜类型砧木品种‘甬站I号’、‘甬站3号’、‘甬站4号’和‘甬站5号’品种真实性的方法。为实现本发明的目的，发明者提供以下技术方案采用CTAB法提取‘甬砧I号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’和‘甬砧5号’及其对照品种的幼叶DNA ;利用4个RAPD引物和3对SSR引物进行PCR扩增(引物名称与序列表中序列号的对应关系如表I所示，引物具体序列见本说明书最后一页所附序列表)；扩增产物经琼脂糖电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。有差异的等位位点，扩增出条带的记为“1”，同一位置无带记为“O” ；将这些差异扩增片段转换为由I和O组成的字符串，即构成DNA指纹图谱，用以区分4份瓠瓜类型砧木品种及其对照。本发明的优点与常规形态鉴定比较，本发明的鉴定结果准确可靠、耗时短、不受环境影响、操作简单，可以同时鉴定多个品种，方便快捷。
四
图I为本发明实施例中，RAPD引物s23、s24、sl48、s255 (左)和SSR引物S1001/1002、S1109/1110、S1127/1128(右)在‘甬砧 I 号’、‘甬砧 3 号’、‘甬砧 4 号’、‘甬石占5号’及其对照材料‘神通力’和‘京欣砧I号’中的扩增。图I中左侧四幅图片自上而下分别是RAro引物s23、s24、sl48、s255在‘甬砧I号’、‘甬砧3号’、‘甬站4号’、‘甬砧5号’及其对照材料‘神通力’和‘京欣砧I号’中的扩增;右侧三幅图片自上而下分别是SSR引物S1001/1002、S1109/1110、S1127/1128在‘甬砧I号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’、‘甬砧5号’及其对照材料‘神通力’和‘京欣砧I号’中的扩增。两组图片样品排列顺序自左至右依次为DNA Marker、‘甬砧I号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’、‘甬砧5号’、‘神通力’和‘京欣砧I号’。图片左侧标注是DNA marker标准分子量，右侧标注是引物名称及差异位点所在片段大小。
五具体实施例方式I、取样播种‘甬砧I号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’、‘甬砧5号’及其对照，待植株长至5-6片真叶时，采集嫩叶lg，_80°C保存。 2、DNA 提取参照 CTAB 法(见Murray HG, Thompson WF. Rapid isolation ofhigher weight DNA. Nucleic Acids Res, 1980,8 :4321),提取新鲜叶片总基因组 DNA。3、PCR 扩增RAPD 和 SSR 的混样体系均为 15 μ I (Fazio G, Staub JE, StevensMR. Genetic mapping and QTL analysis of horticultural traits in cucumber(Cucumissativus L.)using recombinant inbred lines. Theor Appl Genet,2003,107 :864-874),包括 1·5μ1 dNTP(l. 25mM), I. 5ul 10 X buffer, I. 5ul MgCl2 (25mM)，2. Oul 引物(5mM ;SSR两条引物分别添加 1.0ul)，5ul DNA(10ng/ul),0. 05ul Taq (IU)，3. 45ul 超纯水。RAPD 的PCR扩增程序为预变性94°C 4min ;变性93°C 15sec，退火37°C lmin30sec，延伸72°C2min(40个循环);延伸72 °C 6min。SSR的PCR扩增程序为预变性94°C Imin ;变性93 °Clmin，退火 40°C lmin，延伸 72°C 2min(40 个循环);延伸 72°C Imin04,PCR产物检测RAPD扩增产物使用2%普通标准凝胶琼脂糖(DNA片段分离范围500-20Kbp)，SSR使用2. 5%高分辨率标准凝胶琼脂糖(DNA片段分离范围40_lKbp)。添加20 μ I EB (ethidium bromide,溴化乙淀)显色。在 PCR产物中加入 2μ I Loading Dye,电泳2-3小时，电压200-250V。电泳结束后，利用凝胶成像系统观察结果。5、数据收集与分析对4个RAPD引物s23、s24、sl48、s255和3对SSR引物S1001/1002、S1109/1110、S1127/1128 在‘甬砧 I 号’、‘甬砧 3 号’、‘甬砧 4 号’、‘甬砧 5号’及对照材料‘神通力’和‘京欣砧I号’的扩增结果进行赋值，某等位基因扩增出条带的记为“1”，同一位点无扩增条带的记为“O”。将这些差异扩增片段转换为由I和O组成的字符串，即构成品种指纹图谱(表I)。利用7个分子标记产生的11个多态性位点，构建‘甬砧I号’的指纹图谱为o-i-i-i-o-o-i-o-i-i-o，‘甬砧3号’的指纹图谱为1-0-0-0-0-0-1-1-0-0-0, ‘甬砧 4 号’的指纹图谱为 1-1-1-0-1-0-1-0-1-1-0，‘甬砧 5 号’的指纹图谱为 0-0-1-1-0-0-1-1-0-0-1，‘神通力’的指纹图谱为 0-1-1-0-1-0-1-1-0-0-1，
‘京欣砧I号’的指纹图谱为0-0-0-0-0-1-0-0-0-1-0。这些指纹图谱不仅可以有效区分上述四个品种，还可以将它们从形态易混淆的相似品种中甄别出来，起到品种鉴定与保护的作用。表I供试瓠瓜类型砧木品种及对照编号、名称和RAPD/SSR指纹图谱
权利要求
1.本发明用以鉴定‘甬砧I号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’和‘甬砧5号’所使用的方法。本发明利用4个RAro引物(SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 4)和3对SSR引物(SEQ IDNO. 5-SEQ ID NO. 10)，对瓠瓜类型砧木品种‘甬砧I号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’和‘甬砧5号’及对照进行PCR扩增，扩增产生的11个差异位点经过“I”和“O”的赋值，构建品种DNA指纹图谱用以真实性鉴定。发明者提供的技术方案与鉴定指标模糊、鉴定结果易受环境影响的常规形态学鉴定相比，具有鉴定手段灵敏、时间人工成本低、结果准确等优点，且对于批量材料的鉴定更方便。请求对以下权利进行保护
2.本发明用以鉴定‘甬砧I号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’和‘甬砧5号’所使用的4个RAPD 引物和 3 对 SSR 引物的序列，包括 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ IDNO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10。
全文摘要
本发明题为《一种鉴定‘甬砧1号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’和‘甬砧5号’品种真实性的方法》，属于生物领域。鉴别品种真实性对维护生产者和育种者的利益日益重要。砧木品种繁多外观相似，利用形态指标甄别真伪，耗时长可靠性差。为此，发明一种利用分子标记鉴定砧木品种真实性的方法成为当务之急。技术方案为利用4个RAPD引物(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4)和3对SSR引物(SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.10)，对四个品种及对照进行PCR扩增，产生的11个差异位点经过“1”和“0”赋值，构建品种指纹图谱用以真实性鉴定。发明以更灵敏的鉴定手段、更低的时间人工成本，对瓠瓜类型砧木品种‘甬砧1号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’和‘甬砧5号’进行更准确更有效的鉴定与保护。
文档编号C12Q1/68GK102925551SQ20121031865
公开日2013年2月13日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者宋慧, 王毓洪, 张香琴, 应泉盛, 王迎儿, 严蕾艳 申请人:宁波市农业科学研究院