苏丹草品种真实性检测方法及专用引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测或辅助检测苏丹草国审品种方法。本发明提供了一组用于检测或辅助检测苏丹草国审品种的引物组，由引物对P01-引物对P18共18个引物对组成。本发明的实验证明，本发明筛选出18对SSR引物，用其对牧草进行PCR扩增，得到的18种产物的电泳图谱与9种苏丹草国审品种的电泳图谱进行目的特异条带的谱带比较，若18种产物的电泳图谱中至少16种与目的特异条带的谱带一致，则可以候选判断该牧草与为同一品种。根据本发明的引物和方法进行鉴定，可以简单、快速、高效、准确鉴定出待测苏丹草是否为9个国审品种真伪性。
【专利说明】苏丹草品种真实性检测方法及专用引物
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种苏丹草品种真实性检测方法及专用引物。
【背景技术】
[0002]苏丹草(Sorghum, Sudanense)为禾本科一年生草本,原产于非洲北部苏丹(高原)地区，在我国从北到南均有栽培地域极其广泛。在北方地区作为夏季青饲草及冬季青贮草，并且已经形成了我国主要的种子生产基地；南方地区做为长年的家畜青贮草及优良的鱼饲草，素有“渔业青饲料之王”美称。目前通过国家审定的品种有9个，分别是宁农(育成品种)、乌拉特2号(育成品种)、蒙农青饲3号(育成品种)、蒙农青饲2号(育成品种)、新苏2号(育成品种)、乌拉特I号(育成品种)、奇台(育成品种)、盐池(育成品种)、内农I号(育成品种)。
[0003]农业部自2006年开始对全国的生产和销售的草种质量进行了连续抽查，结果显示苏丹草等重要草种品种掺假的现象比较严重，常常发生不法经营者利用假冒伪劣的种子坑农害农，不仅扰乱了正常的种子市场贸易，又造成了很大的经济损失。由于缺乏快速、准确地鉴定方法，该问题迟迟得不到解决。
[0004]传统的品种鉴定多采用形态学鉴定方法，但其鉴定周期长、费用高且易受环境影响。现有的其他品种鉴定方法中，同工酶和蛋白质电泳应用较广，但检测到的位点少、蛋白质类型不多、多态性水平低，不能有效区分同一作物不同品种；RFLP技术较繁琐，对人员设备要求较高；RAPD技术相对简单，然而可靠性差难以在品种鉴定中广泛应用。
[0005]SSR指纹图谱技术在作物育种和品种鉴定中有广泛应用。利用SSR指纹图谱鉴别品种真伪的优越性在于:①数量大，多态性水平高，可鉴定表型难于鉴别的品种不受任何环境因素的影响，可在生长发育的任何阶段取材鉴定分离出的样品DNA可长期保存，这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利；④不仅准确可靠，而且还便于实现自动化。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的是提供用于检测或辅助检测待测草种是否为苏丹草国审品种的引物组。
[0007]本发明提供的引物组，由引物对POl-引物对P18共18个引物对组成；
[0008]所述引物对POl由序列表中序列I所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成； [0009]所述引物对P02由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
[0010]所述引物对P03由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成；
[0011]所述引物对P04由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成；
[0012]所述引物对P05由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成；
[0013]所述引物对P06由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成；
[0014]所述引物对P07由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成；
[0015]所述引物对P08由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成；
[0016]所述引物对P09由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成；
[0017]所述引物对PlO由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成；
[0018]所述引物对Pll由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单链DNA分子组成；
[0019]所述引物对P12由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序列表中序列24所示的单链DNA分子组成；
[0020]所述引物对P13由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单链DNA分子组成；
[0021]所述引物对P14由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单链DNA分子组成；
[0022]所述引物对P15由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成；
[0023]所述引物对P16由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表中序列32所示的单链DNA分子组成；
[0024]所述引物对P17由序列表中序列33所示的单链DNA分子和序列表中序列34所示的单链DNA分子组成；
[0025]所述引物对P18由序列表中序列35所示的单链DNA分子和序列表中序列36所示的单链DNA分子组成；
[0026]上述引物组中的各条引物均独立包装；
[0027]所述苏丹草国审品种为奇台、新苏2号、宁农、乌拉特I号、盐池、乌拉特2号、内农I号、蒙农青饲2号或蒙农青饲3号。
[0028]本发明的另一个目的是提供一种用于检测或辅助检测待测草种是否为苏丹草国审品种的PCR试剂组。
[0029]本发明提供的PCR试剂组，由如下18种PCR试剂组成:
[0030]I)由上述引物组中的引物对P01、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0031]2)由上述引物组中的引物对P02、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0032]3)由上述引物组中的引物对P03、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0033]4)由上述引物组中的引物对P04、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；[0034]5)由上述引物组中的引物对P05、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0035]6)由上述引物组中的引物对P06、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0036]7)由上述引物组中的引物对P07、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0037]8)由上述引物组中的引物对P08、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0038]9)由上述引物组中的引物对P09、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0039]10)由上述引物组中的引物对P10、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0040]11)由上述引物组中的引物对Pll、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0041]12)由上述引物组中的引物对P12、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0042]13)由上述引物组中的引物对P13、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0043]14)由上述引物组中的引物对P14、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0044]15)由上述引物组中的引物对P15、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0045]16)由上述引物组中的引物对P1 6、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0046]17)由上述引物组中的引物对P17、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；
[0047]18)由上述引物组中的引物对P18、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水。
[0048]上述的PCR试剂组中，每个引物对中的每条引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度为0.25 μ mol/L ;所述PCR试剂均独立包装；所述苏丹草国审品种为奇台、新苏2号、宁农、乌拉特I号、盐池、乌拉特2号、内农I号、蒙农青饲2号或蒙农青饲3号。
[0049]含有上述引物组的试剂盒或含有上述PCR试剂组的试剂盒也是本发明保护的范围。
[0050]上述引物组、上述PCR试剂组或上述的试剂盒在检测或辅助检测待测样品是否为苏丹草国审品种中的应用也是本发明保护的范围。
[0051]上述的应用中:所述苏丹草国审品种为奇台、新苏2号、宁农、乌拉特I号、盐池、乌拉特2号、内农I号、蒙农青饲2号或蒙农青饲3号。
[0052]本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测草种是否为9个苏丹草国审品种中任一种的方法。
[0053]本发明提供的方法，包括如下步骤:
[0054]I)用上述引物组中的18个引物对、上述PCR试剂组或权利要求5所述的试剂盒对待测草种和9个苏丹草国审品种进行SSR扩增，电泳检测扩增产物，得到待测草种的18种电泳图谱和9个苏丹草国审品种中每个的18种含有特异扩增条带电泳图谱；
[0055]所述同一引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与同一引物对扩增得到的每个苏丹草国审品种的含有特异扩增条带电泳图谱相对应；
[0056]2)将每个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与其对应的9个苏丹草国审品种中的含有特异扩增条带电泳图谱分别进行比对，若至少16个引物对扩增得到的待测草种的图谱与某苏丹草国审品种的该16对引物扩增得到的图谱分别一致，则待测草种为或候选为该苏丹草国审品种；若少于16个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱的电泳条带与某苏丹草国审品种中的含有特异扩增条带电泳图谱中特异扩增条带组成一致，则待测草种不为或候选不为该苏丹草国审品种；
[0057]所述9个苏丹草国审品种具体为奇台、新苏2号、宁农、乌拉特I号、盐池、乌拉特2号、内农I号、蒙农青饲2号和蒙农青饲3号。[0058]本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测待测草种与对照苏丹草品种是否为同一品种的方法。
[0059]本发明提供的方法，包括如下步骤:
[0060]I)用上述引物组中的18个引物对、上述PCR试剂组或上述的试剂盒对待测草种和对照苏丹草品种进行SSR扩增，电泳检测扩增产物，得到待测草种的18种电泳图谱和对照苏丹草品种的18种含有特异扩增条带电泳图谱；
[0061]所述同一引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与同一引物对扩增得到的对照苏丹草品种的含有特异扩增条带电泳图谱相对应；
[0062]2)将每个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与对照苏丹草品种中的含有特异扩增条带电泳图谱分别进行比对，若至少16个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱的电泳条带均具有与其对应的对照苏丹草品种的含有特异扩增条带电泳图谱中特异扩增条带组成一致的条带，则待测草种与对照苏丹草品种为或候选为同一品种；若少于16个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱的电泳条带具有与其对应的对照苏丹草品种的含有特异扩增条带电泳图谱中特异扩增条带组成一致的条带，则待测草种与对照苏丹草品种不为或不候选为同一品种。
[0063]上述方法中，所述 电泳采用变性聚丙烯酰胺凝胶；所述PCR的模板为基因组DNA。
[0064]待测样品为苏丹草或疑似苏丹草品种。
[0065]每个苏丹草国审品种可以为对应的苏丹草国审品种也可以为确定的苏丹草国审品种。
[0066]上述每个苏丹草国审品种的18对引物扩增的电泳图谱中特异扩增条带的组成如表4所示。
[0067]本发明的实验证明，本发明筛选出18对SSR引物，用其对牧草进行PCR扩增，得到的18种产物的电泳图谱与9种苏丹草国审品种的电泳图谱进行目的特异条带的谱带比较，若18种产物的电泳图谱中至少16种与目的特异条带的谱带一致，则可以候选判断该牧草与之为同一品种，若18种产物的电泳图谱中少于16种与目的特异条带的谱带一致，则可以候选判断该牧草与之为不同品种。根据本发明的引物和方法进行鉴定，可以简单、快速、高效、准确鉴定出待测苏丹草是否为9个国审品种真伪性。
【专利附图】
【附图说明】
[0068]图1为POl引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0069]图2为P02引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0070]图3为P03引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0071]图4为P04引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0072]图5为P05引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0073]图6为P06引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0074]图7为P07引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0075]图8为P08引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0076]图9为P09引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0077]图10为PlO引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果[0078]图11为Pll引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0079]图12为P12引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0080]图13为P13引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0081]图14为P14引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0082]图15为P15引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0083]图16为P16引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0084]图17为P17引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
[0085]图18为P18引物扩增样本1-10的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
【具体实施方式】
[0086]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0087]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0088]下述实施例中所用9个苏丹草国审品种:宁农、乌拉特2号、蒙农青饲3号、蒙农青饲2号、
[0089]新办2号、奇台、盐池、乌拉特I号、内农I号，均可从市场购头；
[0090]表1为国申品种对应编号
[0091]
【权利要求】
1.用于检测或辅助检测待测草种是否为苏丹草国审品种的引物组，由引物对POl-引物对P18共18个引物对组成； 所述引物对POl由序列表中序列I所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P02由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P03由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P04由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P05由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P06由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P07由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P08由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P09由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链DNA分子组成； 所述引物对PlO由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单链DNA分子组成； 所述引物对Pll由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P12由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序列表中序列24所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P13由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P14由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P15由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P16由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表中序列32所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P17由序列表中序列33所示的单链DNA分子和序列表中序列34所示的单链DNA分子组成； 所述引物对P18由序列表中序列35所示的单链DNA分子和序列表中序列36所示的单链DNA分子组成。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于:所述引物组中的各条引物均独立包装; 所述苏丹草国审品种为奇台、新苏2号、宁农、乌拉特I号、盐池、乌拉特2号、内农I号、蒙农青饲2号或蒙农青饲3号。
3.一种用于检测或辅助检测待测草种是否为苏丹草国审品种的PCR试剂组，由如下18种PCR试剂组成: 1)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P01、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 2)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P02、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 3)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P03、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 4)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P04、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 5)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P05、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 6)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P06、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 7)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P07、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 8)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P08、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 9)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P09、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 10)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P10、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 11)由权利要求1或2所述引物组中的引物对PlUPCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 12)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P12、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 13)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P13、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 14)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P14、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 15)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P15、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 16)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P16、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水； 17)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P17、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水；18)由权利要求1或2所述引物组中的引物对P18、PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和水。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂组，其特征在于:每个引物对中的每条引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度为0.25 μ mo I/L ； 所述PCR试剂均独立包装； 所述苏丹草国审品种为奇台、新苏2号、宁农、乌拉特I号、盐池、乌拉特2号、内农I号、蒙农青饲2号或蒙农青饲3号。
5.含有权利要求1或2所述引物组的试剂盒或含有权利要求3或4所述PCR试剂组的试剂盒。
6.权利要求1或2所述引物组、权利要求3或4所述PCR试剂组或权利要求5所述的试剂盒在检测或辅助检测待测样品是否为苏丹草国审品种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述苏丹草国审品种为奇台、新苏2号、宁农、乌拉特I号、盐池、乌拉特2号、内农I号、蒙农青饲2号或蒙农青饲3号。
8.—种检测或辅助检测待测草种是否为9个苏丹草国审品种中任一种的方法，包括如下步骤: 1)用权利要求1或2所述引物组中的18个引物对、权利要求3或4所述PCR试剂组或权利要求5所述的试剂盒对待测草种和9个苏丹草国审品种进行SSR扩增，电泳检测扩增产物，得到待测草种的18种电泳图谱和9个苏丹草国审品种中每个的18种含有特异扩增条带电泳图谱； 所述同一引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与同一引物对扩增得到的每个苏丹草国审品种的含有特异扩增条带电泳图谱相对应； 2)将每个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与其对应的9个苏丹草国审品种中的含有特异扩增条带电泳图谱分别进行比对，若至少16个引物对扩增得到的待测草种的图谱与某苏丹草国审品种的该16对引物扩增得到的图谱分别一致，则待测草种为或候选为该苏丹草国审品种；若少于16个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱的电泳条带与某苏丹草国审品种中的含有特异扩增条带电泳图谱中特异扩增条带组成一致，则待测草种不为或候选不为该苏丹草国审品种； 所述9个苏丹草国审品种具体为奇台、新苏2号、宁农、乌拉特I号、盐池、乌拉特2号、内农I号、蒙农青饲2号和蒙农青饲3号。
9.一种检测或辅助检测待测草种与对照苏丹草品种是否为同一品种的方法，包括如下步骤: 1)用权利要求1或2所述引物组中的18个引物对、权利要求3或4所述PCR试剂组或权利要求5所述的试剂盒对待测草种和对照苏丹草品种进行SSR扩增，电泳检测扩增产物，得到待测草种的18种电泳图谱和对照苏丹草品种的18种含有特异扩增条带电泳图谱； 所述同一引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与同一引物对扩增得到的对照苏丹草品种的含有特异扩增条带电泳图谱相对应； 2)将每个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱与对照苏丹草品种中的含有特异扩增条带电泳图谱分别进行比对，若至少16个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱的电泳条带均具有与其对应的对照苏丹草品种的含有特异扩增条带电泳图谱中特异扩增条带组成一致的条带，则待测草种与对照苏丹草品种为或候选为同一品种；若少于16个引物对扩增得到的待测草种的电泳图谱的电泳条带具有与其对应的对照苏丹草品种的含有特异扩增条带电泳图谱中特异扩增条带组成一致的条带，则待测草种与对照苏丹草品种不为或不候选为同一品种。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述电泳采用变性聚丙烯酰胺凝胶；所述PCR的模板为基因组DNA。
【文档编号】C12Q1/68GK104004838SQ201410215787
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】高秋, 孙娟, 冯葆昌, 马金星, 张义, 贠旭江, 屠德鹏, 李玉荣, 王杰, 齐晓, 刘芳, 李存福, 王梅娟, 何珊珊 申请人:全国畜牧总站