专利名称：凝集素用于识别、纯化干细胞的方法、试剂盒及应用方法
技术领域：
本发明属于生物技术、干细胞、肿瘤学领域，涉及采用凝集素用于识别、纯化干细胞的方法、试剂盒及其应用，具体而言，涉及采用特异识别糖蛋白和/或糖脂糖链末端的凝集素结合物用于从啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的细胞群中识别、纯化干细胞的方法、试剂盒，本发明所公开的方法、试剂盒可有效且精准的用于从所述细胞群中识别、纯化成体干细胞、肿瘤干细胞、癌干细胞，所述含干细胞的样品不带任何外来标记。本发明还涉及获得的干细胞及它们在诸如研究或治疗中的广泛用途。
背景技术：
“凝集素”这一术语最早在1888年出现，人们发现其具有凝集红细胞的特性。简单来说，凝集素也是一种蛋白质，广泛从植物、动物、真菌、细菌等中分离，具有结合糖脂或糖肽末端特异性碳水化合物的特性(SharonN等,Science, 1972.177(53):949-59 ；PusztaiA，植物凝集素，1991.剑桥:剑桥大学出版社)，且其唯一的特异性在于，它们是一组结构上有区别的蛋白质，且可特异性结合细胞膜上的碳水化合物，并进一步通过细胞膜表面寡糖基之间的交联实现对细胞的凝集(Pusztai A，植物凝集素，1991.剑桥:剑桥大学出版社；Sharon N, Trends Biochemistry Sci,1993.18(6):221-226)。众所周知，糖基化是在酶的作用下，实现对蛋白质或脂质附加上糖类的过程。此过程为共转移(co-translational)与后转移修饰的步骤之一,发生于内质网，细胞表面蛋白发生糖基化的几率几乎超过50%。早在二十世纪的八十年代，有研究者发现，凝集素具有结合或杀死胚胎性的细胞癌和生殖系肿瘤细胞的能力，后来又发现，多潜能干细胞表面上的抗原常常显示为糖蛋白或糖脂(Andrews PW等,Hybridoma, 1984.3 (4):347-61 ；Pere MF等，Differentiation, 1988.39 (2): 139-49),这提示蛋白质特异性糖基化可能是细胞具有多潜能性的标志。
上述研究结果表明 凝集素可能具有与多能性的细胞相互作用的特征(Draber P等，Somat Cell MolGenet, 1984.10:435-443 ；KosmehI H 等，Neoplasma 1989.36:29-39)。而且，膜结合蛋白和对应配体的低聚糖化修饰常常介导细胞外分子或信号启动的胞内信号传导(Haltiwanger RS.Curr Opin Struct Biol2002.12 (5):593-8 ;Xia L 等，Blood,2004.104(10):3091-6)。人们发现，在许多细胞相关的事件，例如细胞分化(Moody AM等，Cell, 2001.107(4):501-12)以及肿瘤(Reis CA等，J Clin Pathol, 2010.63(4):322-9)发生中，均可观察到蛋白糖基化的动态变化。在胚胎水平，例如，小鼠胚胎多个组织器官的上皮细胞膜上，研究者发现其上有结合特异性凝集素的位点(Carter WG 等，J.Biol.Chem, 1975.250(7) =2756-62 ；NoguchiM等，J.Embryol.Exp.Morphol, 1982.72:39-52),进一步观察发现，不同类型的凝集素在识别胚胎不同组织上皮方面具有差异性，有趣的是，当用低剂量放射件射线照射小鼠胚胎后(0.25,0.50和0.75Gy)，细胞膜上结合SBA、PNA和DBA三种凝集素的表达量增加(Nievergelt-Egido MC等，Radiat Environ Biophys, 1993.32 (2):119-28),而且在胚胎不同区域，三种凝集素的结合强度不同。随后在胚胎期发育的胰腺上皮和管状细胞膜上，其他研究者进一步发现，上述细胞膜上有可特异性结合凝集素的位点，这表明识别细胞膜上特异性糖表位的凝集素可能作为一个指示细胞具有多能性的标志，可用于表征胰腺前体细胞(Kobayashi 等,BBRC, 2002.293 (2):691-7)。近期研究发现,路易斯寡糖(Lewis X antigen)在小鼠的胚胎干细胞、多潜能细胞和胚胎癌性细胞的细胞膜上均有表达，而不在人类相应的胚胎干细胞、内细胞团或胚胎癌性细胞上表达(Muramatstu TA等，GlycoconjugateJournal, 2004.21:41-45),未来还需要进一步研究这一不一致性。采用细胞生物学和生物化学方法，来自多个研究者的实验研究发现，人类胚胎干细胞与其蛋白的糖基化密切相关(Xia L等，Blood, 2004.104:3091-6 ；Satomaa T等，BMCCell Biol, 2009.10:42 ；Venable A 等，BMCDev Biol 2005 ;5:15)。细胞膜上的特异性糖原表位可作为一个新的、特异性标志，用于反映小鼠胚胎的早期分化状态，其表达早于目前所发现的胚胎特异性抗原，如SSEA1，CD9和FA，而且，随着胚胎分化进程的发展，其膜上特异性糖原表位的表达逐渐降低并消失(Nash Rodney等,2006, stem cell.25(4):974-82)。Wang等采用培养的胚胎干细胞或诱导多能干细胞为研究对象，当用凝集素芯片分析细胞抽提物后发现，特异性的凝集素可用来识别和分离胚胎干细胞(Wang YC等，Cell Research,2011.1-13)。。在成体水平，例如，识别D-半乳糖的刀豆凝集素(PNA)可用来对啮齿动物的造血干细胞进行进一步分群(Salner AL 等，1982, J Natl Cancer Inst.68 (4):639-41),甚至可用来从神经组织中识别和分离出PNA阳性的细胞群(Rietze RL等，Nature,2001.412(6848):736-9)，分选的细胞可能是干细胞。最近的研究发现，CD133+的人造血干细胞和祖细胞的N-糖基化模式与N-glycan结构和基因表达密切相关(Hemmoranta H等，Exp Hematol,2007.35(8):1279-92)。肿瘤/癌与凝集素肿瘤是机体细胞失去对其生长的正常调控而形成的新生物，是细胞自身调控和其所处的微环境相互作用的结 果，其治疗仍是一个世界难题。目前肿瘤研究领域的一个研究热点是癌干细胞(Cancer Stem Cells, CSCs)。早期由多伦多大学的分子生物学家JohnDick研究者提出“癌干细胞”理论(John Dick等，Nature, 1994.17:645-648)，这一新理论表明，癌症的发生及难于根治的在于其内癌干细胞(CSCs)的存在，随后的多个癌症研究中的研究结果支持此理论(ReyaT等，Nature, 2001.414:105-111),源自其他组织的进一步研究证实了癌干细胞是存在的，它们在例如血液、乳腺、脑组织、肺组织和肠组织中存在(A1-Hajj M 等，PNAS，2003.100:3938-3988) ；He 等，Nat Genet, 2007.39:189-198 ；Kim CF等，Cell, 2005.121:823-835 ；Lapidot T 等，Nature, 1994.367:645-648 ；Ricc1-VitianiL 等，Nature, 2006 ；Singh SK 等，Nature, 2004.432:396-401 ；YiImaz OH 等，Nature,2006.441:475-482)。“癌干细胞”的提出给肿瘤的治疗带来曙光，因而，如果能够识别癌干细胞将具有及其重要的临床意义，例如通过靶向癌干细胞从而治愈肿瘤等，将产生重大的应用价值和经济效益。然而，遗憾的是，现在尚没有很有效的方法从肿瘤组织中识别、分离出癌干细胞，这也意味着在治疗中，不可能准确而彻底地清除掉癌干细胞。这大大阻碍了针对肿瘤的有效治疗。研究发现，肿瘤细胞表面和其所处的微环境中大量糖链修饰改变以及凝集素受体功能异常在肿瘤发生发展和转移过程中发挥极其重要的作用。其中，糖链合成的调控以及糖链与凝集素的相互作用参与了肿瘤生物学行为的各个方面。凝集素已广泛应用于肿瘤细胞表面糖连接物的研究，其在肿瘤的生物学行为研究、诊断、治疗及其预后方面起着十分重要的作用。成体干细朐:成体干细胞是另外一种特殊干细胞群，越来越多的证据表明成体干细胞可见于多种成熟组织(MooreKA, Science, 2006.311(5769): 1880-1885)，而成体干细胞研究的基础和其在临床上的应用先决条件和最关键条件之一是对干细胞的有效且精准筛选分离。当前，研究者已鉴定到多个成体干细胞相关的分子表面标志，例如Thy-llow、FLK2-Lineage-Sca-l+c_Kit+ 用于识别造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs) (Christemsen JL 等，PNAS,2001.98: 14541-14546 ；Uchida N 等，Experimentalhematology,1996.24:649-659), ISL1 +、Sca-1+ 或 c_kit+(Laugwitz KL,等，Nature.2004.433(7026):647-653 ；0kada S 等，Blood，1991.78 (7):1706-12 ；Matsuura K等，J Biol Chem，2004.279(12):11384-91), a 6brilOG7dim 用于识别表皮干细胞(LiA 等，PNAS, 1998.95(7):3902-7 ；Tani H 等，PNAS, 2000.97(20):10960-10965 ；Lavker RM 等，PNAS, 2000.97(25):13473-75)，虽然在成体干细胞特异分子标志方面取得了一定进展，但从成体中分离干细胞仍是极具挑战性的任务，一方面在于其数量较少且更难于定位、筛选分离各种组织特异性干细胞，另外一方面在于缺少可靠的特异性分子标记物对其进行识另O，目前特异的细胞表面标记很难达到共识，其有效性需要进一步分析。
发明内容
本发明的目的在于公开一种识别、纯化干细胞的方法、试剂盒及其应用方法，并进
一步拓展其应用。本发明人为实现上述目的，进行了深入研究，结果本发明人惊喜的发现，特异性的凝集素不仅可用于识别啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的正常组织或器官中的特异性成体干细胞、肿瘤干细胞、癌干细胞，而且也可用于从来源于所述物种的细胞群中纯化出所述干细胞。本发明公开了一种采用凝集素用于识别、纯化干细胞的方法，其包括:(I)在使所述细胞群与细胞预处理试剂预先接触条件下，使样品接触一种凝集素，后者含有:(a)至少一种凝集素，其可识别糖蛋白和/或糖脂糖链末端特异位点，该凝集素与(b)至少一种结合物进行直接或间接连接；和(2)将与所述凝集素结合物结合的细胞群从所述样品中分离，获得富含干细胞的样品，其中，所述细胞上存在与所述凝集素特异亲和性的受体表明它们是干细胞。其中，可通过加入洗脱糖的方法把所述凝集素结合物从所述细胞群上洗脱，从而获得不含任何外来标记的富含干细胞的样品。其中，细胞预处理过程选择采用沉淀或裂解法沉淀或裂解细胞群中的红细胞的试齐U，所述试剂可选择为质量浓度为0.1 20%的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种；或可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于0.9%的生理盐水溶液的任一一种；或可选择泛影酸钠-葡聚糖、HIT0PAQUE, Ficoll的任一一种进行细胞预处理， 其中，所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。
其中，所述凝集素结合物中的凝集素包括天然的或化学合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的一种或两种以上的组合，所述凝集素的浓度为0.001 40mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于120分钟，孵育温度为小于或等于38°C。其中，所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种。其中，所述与凝集素结合的闻分子量的生物大分子的分子量在一万道尔顿(Mw)至八十万道尔顿(Mw)之间，其中所述高分子量的生物大分子可选择为牛血清白蛋白、羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一种。其中，所述含干细胞的细胞群来源于啮齿动物、人类或其他哺乳动物的成体组织、肿瘤/癌前组织、肿瘤/癌性组织、转移瘤/癌组织或其他潜在包含干细胞的一种或两种以上组织的组合，或选择来自所述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。本发明还公开采用凝集素用于识别、纯化干细胞的试剂盒及其应用方法，其中，所述凝集素还可用于确定组织、细胞群中干细胞存在与含量，其在用于从所述细胞群中富集、提纯干细胞的用途。所述用于识别、纯化干细胞的试剂盒，其包括:I)细胞预处理试剂A ；2)识别、纯化试剂B ；3)以及任选的容器；`其中，所述细胞预处理试剂A可选择为质量浓度为01 20%的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种；或可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于0.9%的生理盐水溶液的任一一种；所述细胞预处理试剂或可选择泛影酸钠-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一种，其中，所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。其中，识别、纯化试剂B为凝集素结合物，包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的一种或两种以上的组合，其中所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种，所述凝集素的浓度为
0.001 40mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于120分钟，孵育温度为小于或等于 38。。。其中，所述含干细胞的细胞群是啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的正常成体和或病变、肿瘤、癌前、癌性、癌转移组织，或来自所述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。其中，随后可选择采用荧光活化细胞分选法用于鉴定和分选结合凝集素结合化合物的细胞群或选择沉淀法分离结合凝集素的所述细胞群，进一步，分离的所述干细胞，其包含细胞膜上的可与凝集素结合的受体。其中，根据本发明方法、试剂盒获得的纯化的干细胞，可进一步通过加入洗脱糖的方法把所述凝集素结合物从所述细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。
其中，所述识别、纯化的干细胞包括全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、成体干细胞、肿瘤干细胞、癌干细胞，进一步，其与已知干细胞标志物接触。其中，本发明所述试剂盒还包括洗脱糖，用于把所述凝集素结合物从所述细胞上洗脱，从而使得所述获得含干细胞的样品不带任何外来标记。其中，所述获得的干细胞还可加入生理盐水、PBS缓冲液、HBSS缓冲液以调整干细胞的浓度和体积。其中，根据本发明所述的试剂盒应用方法，其应用方法包括以下步骤:(I)所述细胞样本与细胞预处理试剂A接触:如加入红细胞沉淀剂,选择取上清；如加入红细胞裂解液，选择离心后丢弃上清取细胞沉淀；(2)使经过步骤(I)的所述细胞群与所述识别、纯化试剂B接触，所述凝集素的浓度为0.001 40mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于120分钟，孵育温度为小于或等于38°C ；(3)分离获得凝集素阳性的细胞群:可选择采用荧光活化细胞分选、磁珠分选法或静置沉淀法；(4)加入洗脱糖把所述凝集素结合物从经步骤(3)获得的所述细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物，进一步，获得的干细胞还可加入生理盐水、PBS缓冲液、HBSS缓冲液以调整干细胞的浓度和体积。 所述分离的干细胞用于，例如生物化学、分子生物学或标志物水平的进一步分析，进一步，所述细胞可以是同一表型或不同表型的集合，其中所述识别的干细胞包含至少I个，所述纯化的干细胞包含至少为I %，优选包含至少50%，更优选包含至少70%，更优选包含至少80 %，最优选包含至少90 %。进一步，所述分离的干细胞其细胞表面有可与凝集素结合物中的凝集素结合的受体，进一步所述细胞与已知干细胞标志物接触，例如Sca-l、Alb、c-Kit、⑶90、Nkx2.5分子。进一步，根据本发明所述的方法，可用于制备用于诊断样品中干细胞存在和/或含量的诊断剂应用。其中，本发明所述试剂盒识别、纯化的干细胞为成体干细胞、肿瘤干细胞、癌干细胞，所述识别的干细胞包含至少I个，纯化的干细胞的纯度至少为1%。本发明所述成体干细胞，优选出生后的组织获得的干细胞。在诸如人类的哺乳动物中，优选的，从至少I岁大的个体中获得的成体干细胞，优选发育期后的个体，例如成年。在本发明的优选实施方案中，所述干细胞是成体干细胞、肿瘤干细胞和/或癌干细胞。其中，检测或分离干细胞的方法包括采用荧光活化细胞分选法(FACS)用于鉴定和纯化结合凝集素结合物的细胞。其中，根据本发明所述方法、试剂盒获得的分离的干细胞，进一步，分离的干细胞，其包含细胞膜上的可与凝集素结合的受体。据此，本发明通过上述方法、试剂盒实现从所述啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的样品中识别、纯化干细胞，并进一步获得不带任何外来标记的含所述干细胞的样品，本发明所述分离的干细胞群在基础与应用研究、组织工程、治疗、修复受损或病变组织、药物筛选等中的应用。 本发明所述试剂盒具有普遍适用性，可用于准确且快速识别、纯化啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的干细胞。进一步，所述试剂盒具有使用简捷、可工业化生产、特异性强、实用有效，应用前景广泛的优点。
图1识别、纯化肺干细胞的结果图，具体如实施例1。A图表示同型对照组的流式图(n = 2) ;Β图表示分离、纯化肺干细胞的流式图，从细胞群中所纯化的凝集素阳性活细胞数量约为4.5% (n = 2) ；C图表示所述肺干细胞的纯度。图2骨髓、脐带血中识别、纯化干细胞结果图，具体如实施例2。A图表示采用PE标记的蜗牛凝集素(PE-HA)从骨髓细胞群中识别、纯化干细胞的结果，阳性细胞数量为2.6% (η = 2),B图表示细胞纯度为95.7%；C图表示采用PE标记的荆豆凝集素(PE-UEA)从脐带血细胞群中识别、纯化干细胞的结果，阳性细胞数量为3.5%(n = 2)，D图表示细胞纯度为96.8 %。
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图3识别、纯化肝癌干细胞的结果图，具体如实施例3。A图表示同型对照组，对照组细胞数量为0.13% (n = 2) ；Β图表示采用TRITC标记的凝集素SJ(T-SJ)作为分子标记从肝癌组织中提纯干细胞的结果，凝集素阳性细胞数量为5.6% (n = 2) ；C图表示新分离的T-SJ阳性肝癌干细胞群，星号指CD90+(绿色)细胞，其中细胞核用DAPI染色，图片的放大倍数为100倍。图4采用本发明试剂盒从细胞群中识别、纯化肝干细胞和肺干细胞的结果图，具体如实施例4。A-C图表示肝干细胞的纯化及显微镜观察结果，其中，A图表示同型对照组，对照组细胞数量为0.05% (n = 2) ；Β图表示采用明胶结合的凝集素PT从肝脏细胞群中纯化干细胞并用FITC-PT进行流式鉴定分析的结果，凝集素阳性细胞数量为2.6% (η = 2)；C图表示新分离的细胞群，短箭头指F-PT+/Alb+肝干细胞，星号指F-PT+/Alb-肝干细胞。A’ -C’图表示肺干细胞的纯化及显微镜观察结果，其中，A’图表示同型对照组，对照组细胞数量为0.19% (n = 2) ;Β’图表示采用明胶结合的凝集素RC从肺脏细胞群中纯化干细胞并用TRITC-RC进行流式鉴定分析的结果，凝集素阳性细胞数量为4.3% (n = 2) ;C’图表示新分离的细胞群，箭头指T-RC+(红色)/c-Kit+(绿色)肺干细胞。细胞核用DAPI染色，图片的放大倍数为100倍。图5采用本发明试剂盒从细胞群中识别、纯化心干细胞的结果图，具体如实施例
5。A图表示同型对照组,对照组细胞数量为0.1% (n = 2) ；Β图表示采用FITC标记的凝集素SJ(F-SJ)作为分子标记从心脏细胞群中纯化干细胞的结果，凝集素阳性细胞数量为
4.9% (n = 2) ；C图表示新分离的F-SJ阳性的细胞群，其中细胞核用DAPI染色，短箭头指F-SJ阳性心脏干细胞，长箭头指F-SJ+/Nkx2.5+心脏干细胞，图片的放大倍数为100倍。
具体实施例方式以下结合具体实施例以详细说明本发明的优点，本领域的技术人员应当理解，本发明的实施例目的是为了清楚的说明本发明的优点，并不是用于限制本发明，任何基于本发明的修饰、替换、改变均落在本发明的精神范畴和保护范围之内。如本发明所述，除非上下文另有明确指示，否则没有限定对象的含义。如本领域技术人员所理解的，本发明文中“一种”指“至少一种”。术语“包含”、“包括”、“含有”、“选择”是同义词，是具有包容性的或者开放性的，并且不排除额外的未详述的成员、要素或方法步骤。如本发明所述，术语“细胞群”是指一个或一个以上的细胞的组合，通常是指一组细胞，除非另有说明，否则该术语是指由本发明所述分离的细胞组成或包含此处分离的细胞的细胞群体。如本发明所述，术语“组织”包括从啮齿动物、人类或其他哺乳动物获得的正常组织或器官标本、肿瘤/癌前组织、肿瘤/癌组织、转移瘤/癌组织。所述细胞群源自啮齿动物、人类或其他哺乳动物正常组织或器官标本、肿瘤/癌前组织、肿瘤/癌组织、转移瘤/癌组织，源自上述物种中所制备的原代细胞群、所述细胞群的传代细胞或所建立的细胞系中获得，其可由具有共同表型的细胞组成或包含至少部分具有共同表型的细胞组成，当细胞在一个或多个显著特征上基本相似或一致时，可以认为细胞具有共同表型，其特征包括但不限于形态外观，某细胞成分或产物(RNA、蛋白质或其它物质)的表达的有无或水平、某生化途径的活力、增殖能力和或动力学行为、分化潜能和或对分化信号的响应或体外培养行为。因此这种显著特征可以定为一个细胞群或其部分。如本发明所述，术语“干细胞”是指能够长期自我更新(即不分化而能够增殖)的祖细胞，处于静息或增殖，其中干细胞的后代或至少其一部分基本保持了亲代干细胞未特化的或者相对较少特化的表型、分化潜能、以及增殖能力。该术语包括能够基本上无限自我更新的干细胞，即:和亲代相比，后代或其部分进一步增殖的能力没有显著降低，以及表现出有限的自我更新的干细胞，即:和母细胞相比，后代或其部分进一步增殖的能力显著降低。基于其产生细胞的类型，所述干细胞或祖细胞可以是多能的、全能的、专能的、或单能的一种或以上的组合。术语“含干细胞的细胞群”在本发明中指含有至少一种干细胞或祖细胞，或者包含部分祖细胞或干细胞的细胞群。通常，所述部分的干细胞或祖细胞可以具有共同表型，也可具有不同表型。如本文所用的，本发明文中术语“啮齿动物”指大鼠、小鼠等；“哺乳动物”指人类、牛、马、狗、兔、猴等。如本文所用的，术语“离体”包括离开动物或人类的组织或细胞且在体外保存或增殖，例如保存在培养容器中。术语“活检”包括采用本领域普遍了解的方法从动物或人类组织或器官中获得组织。本文中的“正常组织或器官标本”指健康的、未转化的、非恶性、非癌性或非致瘤的 组织或器官标本。任何病理学家、本领域的技术人员能够确定组织是否是健康的、未转化的、非恶性、非癌性或非致瘤的。本发明源于本发明人的深入研究，本发明人惊喜的发现特异凝集素可用于从啮齿动物、人类或其他哺乳动物正常组织或器官标本、肿瘤/癌前组织、肿瘤/癌组织、转移瘤/癌组织中识别、纯化出成体干细胞、肿瘤干细胞或癌干细胞，进一步可用于从来源于上述组织的原代细胞群、传代细胞群、建立的细胞系中识别、纯化出所述干细胞。本发明的目的在于公开一种采用特异凝集素结合物用于识别、纯化干细胞的方法，其中包括，采用特定凝集素结合物用于从啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的样品中识别、纯化成体干细胞、肿瘤干细胞、癌干细胞的方法，其中，所述样品源自啮齿动物、人类或其他哺乳动物的离体、活检或通过常规手段获得的任意一种或两种以上组织中制备的原代细胞群、传代细胞群、细胞系。本发明的另一目的在于公开一种从含干细胞的细胞群中识别和纯化干细胞的试剂盒及其应用方法，其中，所述细胞群源自啮齿动物、人类或其他哺乳动物的任意一种或两种以上组织中制备的原代细胞群、传代细胞群或建立的细胞系。进一步，所述试剂盒具有使用简捷、特异性强、实用有效、可工业化生产、应用前景广泛的优点。本发明公开了一种采用凝集素用于识别、纯化干细胞的方法，其包括:
(I)在使所述细胞群与细胞预处理试剂预先接触条件下，使样品接触一种凝集素，后者含有:(a)至少一种凝集素，其可识别糖蛋白和/或糖脂糖链末端特异位点，该凝集素与(b)至少一种结合物进行直接或间接连接；和(2)将与所述凝集素结合物结合的细胞群从所述样品中分离，获得富含干细胞的样品，其中，所述细胞上存在与所述凝集素特异亲和性的受体表明它们是干细胞。其中，可通过加入洗脱糖的方法把所述凝集素结合物从所述细胞群上洗脱，从而获得不含任何外来标记的富含干细胞的样品。其中，细胞预处理过程选择采用沉淀或裂解法沉淀或裂解细胞群中的红细胞的试齐U，所述试剂可选择为质量浓度为0.1 20%的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种；或可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于0.9%的生理盐水溶液的任一一种；或可选择泛影酸钠-葡聚糖、HITOPAQUE, Ficoll的任一一种进行细胞预处理过程，其中，所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。其中，所述凝集素结合物中的凝集素包括天然的或化学合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的一种或两种以上的组合，所述凝集素的浓度为0.001 40mg/ml，进一步，所述凝集素的浓度至少为0.001mg/ml,至少为0.5mg/ml,至少为3mg/ml,至少为6mg/ml,至少为12mg/ml,至少为20mg/ml,至少为25mg/ml,至少为30mg/ml,不超过40mg/ml。其中，所述凝集素结合物与所述细胞群接触的时间为小于或等于120分钟，进一步，接触时间至少为lmin、至少为lOmin、至少为20min、至少为30min、至少为40min、至少为lhrs、至少为 2hrs。其中，所述凝集素结合物与细胞群的孵育温度为小于或等于38°C。进一步，至少为2°C、至少为8°C、至少为12°C、至少为16°C、至少为20°C、至少为24°C、至少为28°C、至少为32°C、不超过 38 °C。其中，所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种。其中，所述与凝集素结合的闻分子量的生物大分子的分子量在一万道尔顿(Mw)至八十万道尔顿(Mw)之间，其中所述高分子量的生物大分子可选择为牛血清白蛋白、羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一种。其中，所述含干细胞的细胞群来源于啮齿动物、人类或其他哺乳动物的成体组织、肿瘤/癌前组织、肿瘤/癌性组织、转移瘤/癌组织或其他潜在包含干细胞的一种或两种以上组织的组合，或选择来自所述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。本发明还公开采用凝集素用于识别、纯化干细胞的试剂盒及其应用方法，其中，所述凝集素还可用于确定组织、细胞群中干细胞存在与含量，其在用于从所述细胞群中富集、提纯干细胞的用途。所述用于识别、纯化干细胞的试剂盒，其包括:
I)细胞预处理试剂A ；2)识别、纯化试剂B;3)以及任选的容器；其中，所述细胞预处理试剂A可选择为质量浓度为0.1 20%的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种；或可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于0.9%的生理盐水溶液的任一一种；所述细胞预处理试剂或可选择为泛影酸钠-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一种，其中，所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。其中，识别、纯化试剂B为凝集素结合物，包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的一种或两种以上的组合，其中所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种，所述凝集素的浓度为
0.001 40mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于120分钟，孵育温度为小于或等于 38。。。其中，所述含干细胞的细胞群是啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的正常成体和或病变、肿瘤、癌前、癌性、癌转移组织，或来自所述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。其中，随后可选择采用荧光活化细胞分选法用于鉴定和分选结合凝集素结合化合物的细胞群或选择沉淀法分离结合凝集素的所述细胞群，进一步，分离的所述干细胞，其包含细胞膜上的可与凝集素结合的受体。`其中，根据本发明方法获得的纯化的干细胞，可进一步通过加入洗脱糖的方法把所述凝集素结合物从所述细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。其中，本发明所述试剂盒还包括洗脱糖，用于把所述凝集素结合物从所述细胞上洗脱，从而使得所述获得含干细胞的样品不带任何外来标记。其中，所述识别、纯化的干细胞包括全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、成体干细胞、肿瘤干细胞、癌干细胞，进一步，其与已知干细胞标志物接触。其中，所述获得的干细胞还可加入生理盐水、PBS缓冲液、HBSS缓冲液以调整干细胞的浓度和体积。其中，根据本发明所述的试剂盒应用方法，其应用方法包括以下步骤:(I)所述细胞样本与细胞预处理试剂A接触:如加入红细胞沉淀剂,选择取上清；如加入红细胞裂解液，选择离心后丢弃上清取细胞沉淀；(2)使经过步骤(I)的所述细胞群与所述识别、纯化试剂B接触，所述凝集素的浓度为0.001 40mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于120分钟，孵育温度为小于或等于38°C ；(3)分离获得凝集素阳性的细胞群:可选择采用荧光活化细胞分选、磁珠分选法或静置沉淀法；(4)加入洗脱糖把所述凝集素结合物从经步骤(3)获得的所述细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物，进一步，获得的干细胞还可加入生理盐水、PBS缓冲液、HBSS缓冲液以调整干细胞的浓度和体积。
其中，本发明所述识别、纯化的干细胞为成体干细胞、肿瘤干细胞、癌干细胞，进一步，所述分离干细胞其细胞表面有可与凝集素结合物中的凝集素结合的受体，进一步与已知干细胞标志物接触，例如Sca-1、Alb、c-Kit、CD90、Nkx2.5分子。其中，本发明还包括采用所述凝集素用于确定样品中干细胞存在与含量。其中，本发明所述结合凝集素的结合物也可选择与允许放射性成像、正电子发射断层扫描、核磁共振成像或X射线或计算机断层扫描的物质结合。其中，凝集素阳性细胞群的提纯(纯化)可采用流式细胞仪(与荧光素结合的凝集素)、磁珠筛选(包被了凝集素的磁珠)、吸附柱或其它已知的提纯手段获得，例如，免疫亲和提纯，结合化合物与固体支持物结合，再比如，淘选，结合化合物与组织培养皿结合。进一步，如果用荧光素标记凝集素，利用流式细胞仪的方法从细胞群中纯化目标细胞是优选的，更优选荧光激活细胞分类仪(FACS)分离所述细胞，通过使用该装置，可以自动分离、回收目标细胞。进一步，根据本发明的方法、试剂盒所识别的干细胞包含至少I个，进一步，根据本发明的方法、试剂盒所提纯干细胞的纯度至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%、至少50%、至少45%、至少40%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%、至少15%、至少10%、至少5%或至少1%。应当理解，许多凝集素都是本领域已知的信息。术语“凝集素”是指共有结合糖脂或糖蛋白特异性的碳水化合物基团特性的蛋白质组。所述凝集素可以从天然来源纯化凝集素，例如从植物、动物、真菌、藻类和细菌，或者选择修饰的凝集素或其衍生物(天然的或合成的)，或者通过化学合成它。凝集素衍生物包括多-亚单位凝集素中的一个或多个亚单位。在一个优选的实施方案中 ，凝集素可选择植物凝集素，凝集素可以商业上从许多商业供应商那里获得，例如Sigma公司。进一步，所述结合凝集素的结合物也可选择与允许放射性成像、正电子发射断层扫描、核磁共振成像或X射线或计算机断层扫描的物质结合。本发明还涉及凝集素结合物在用于从所述细胞群中识别、纯化干细胞的用途。本发明的试剂盒的瓶中的凝集素组合物可以是药学上可接受的溶液的形式，例如与无菌盐水、PBS缓冲液或其它药学上可接受的无菌液体组合。或者，可以冻干或干燥的凝集素组合物，在此类情况下，试剂盒还任选的包含装在容器中的药学上可接受的溶液，例如生理盐水、PBS缓冲液等，优选无菌的，以溶解所述冻干或干燥凝集素组合物。本发明所述的样品包括，例如能够通过将组织或器官标本机械剪切、或破碎成更小的组织块从而从实体器官中获得单细胞悬液。任选的，能够通过诸如化学制剂例如EDTA和或通过使用，胶原酶、分散酶、胰蛋白酶或胰酶制剂的消化特性将获得的组织小块进一步分散为单个的细胞。骨髓和或(脐带)血液、尿液、脑脊液可被视为天然细胞悬液。其中，根据本发明所述的方法、试剂盒可获得的分离的结合凝集素结合物的干细胞，当需要从凝集素结合物分离干细胞时，能够通过本领域技术人员所知道的多种方法来进行分离，例如，通过加入洗脱糖，或通过改变PH值或盐浓度来进行所述干细胞与凝集素结合物的分离。本领域的技术人员应当理解，所述分离的干细胞及其子代也属于本发明的精神范畴和保护范围。分离的干细胞，其包含细胞膜上的可与凝集素结合的受体。基于本发明所述的分离的干细胞，可对其进行基因修饰，例如，使所述干细胞与核酸接触以修饰基因组序列，然后分离其中基因组序列已被修饰的干细胞，之后应用于治疗等应用。进一步，任何对基于本发明所获得的干细胞的修饰、应用，例如通过任何本发明所述的方法获得的干细胞或干细胞的组合物在制备用于治疗受损或患病组织的药物中的用途，这均属于本发明的精神范畴和保护范围。进一步，采用本发明所述识别纯化方法、试剂盒所获得的干细胞群在基础与应用研究、组织工程、治疗、修复受损或病变组织、药物筛选等中的应用。实施例实施例1、肺干细胞的识别及其纯化材料:DAP1、双花扁豆凝集素DBA购自Sigma，胶原酶(Sigma)、胎牛血清、DMEM/F-12K培养基、血球计数板、氯化铵(IX)。洗涤缓冲液:PBS(pH值为7.4±0.1);封闭缓冲液:在洗涤缓冲液(PBS)中加入3% BSA ;抗原修复液:柠檬酸缓冲液；透膜缓冲液:TBS (0.1% Triton+PBS)。其中，凝集素的结合物选择为FITC标记。a)新鲜活检肺组织放入无菌培养皿中，用PBS缓冲液清洗3次，每次3 5min，随后，用无菌眼科剪剪切组织为小碎块，转入盛有胶原酶/胰蛋白酶消化液的50ml离心管中，在37°C, IOOrpm消化45min 60min,随后加入4°C预冷的含10%胎牛血清(Fetal bovineserum, FBS)的DMEM/F12K培养基终止反应，再用一次性注射器将经消化的组织块吹打成单细胞悬液，之后，在4°C，以200g离心3 5min，弃上清后加入4°C预冷的含2% FBS的PBS，轻轻混匀，经180目筛网过滤入另一个50ml离心管中，加入NH4C1裂解液后混匀，室温放置3 5min，在4°C，以200g离心3 5min，弃上清后加入Iml 4°C预冷含2% FBS的PBS混匀，用血球计数仪计数细胞数量，细胞被等分为两份，一份加入F-DBA，其中凝集素的浓度为5mg/ml，一份加入等体积过量的同型对照(图1.A)，两份细胞均在37°C避光孵育30 60min，之后，在4°C，以200g离心3 5min后，丢弃上清，加入4°C预冷的含2% FBS的PBS重悬细胞，流式细胞仪分选F-DBA+细胞群(图1.B)，纯化的干细胞纯度为94% (图1.C)。在分析前，添加碘化丙碇(PD来排除分析中的死细胞。结果:采用本发明的方法能够识别肺组织中的干细胞并进一步可对其进行纯化(图1)，可进一步加入N-乙酰胺半乳糖胺把所述凝集素结合物从所述细胞群中洗脱，从而获得不带任何外来标记的细胞样品，并进一步，加入生理盐水调节所述样品中干细胞的浓度和体积。实施例2、骨髓、脐带血干细胞的识别及其纯化分别制备骨髓、脐带血。材料:同实施例1,其中右旋糖酐(Sigma)、HP、UEA购自Vector,凝集素的结合物为牛血清白蛋白(BSA)。方法:a):加入6 15%质量浓度的右旋糖酐于骨髓细胞悬液中，接触细胞的时间为30min从而沉淀红细胞，随后吸取上清在4°C，以230g离心3 5min，弃上清后加入4°C预冷的含2% FBS的PBS，轻轻混匀，经200目筛网过滤入另一个离心管中用血球计数仪计数细胞数量，胎盘蓝染色细胞存活率98%，随加入BSA结合的凝集素HP，其中，凝集素的浓度为1.2mg/ml，在35°C条件下接 触60min后，吸取下层细胞沉淀，分选的细胞群可进一步用洗脱糖N-乙酰半乳糖胺把凝集素结合物从细胞膜上洗脱下来，在4°C，以230g离心2 3min，弃上清后加入4°C预冷含1% FBS的PBS混匀。随后，在4°C，以230g离心3 5min后，丢弃上清，加入4°C预冷的含I % FBS的PBS重悬细胞，从而获得不含任何外来标记的细胞群，进一步可加入PBS缓冲液调节干细胞的浓度和体积。采用流式细胞仪鉴定分析所述细胞群的数量及纯度，结果表明阳性细胞的百分比为2.6% (图2.A)，识别、纯化的干细胞纯度为95.7% (图2.B)。在分析前，添加碘化丙碇(PI)来排除分析中的死细胞。b)加入6 15%质量浓度的右旋糖酐于脐带血细胞悬液中，接触细胞的时间为40min从而沉淀红细胞，随后吸取上清在4°C，以220g离心3 5min，弃上清后加入4°C预冷的含2% FBS的PBS，轻轻混匀，经160目筛网过滤入另一个离心管中用血球计数仪计数细胞数量，胎盘蓝染色细胞存活率98%，离心丢弃上清后加入BSA结合的凝集素UEA，其中，凝集素的浓度为2.lmg/ml，在37°C条件下接触45min后，吸取下层细胞沉淀，识别、纯化的细胞群可进一步用洗脱糖海藻糖把凝集素结合物从细胞膜上洗脱下来，在4°C，以220g离心2 3min，弃上清后加入4°C预冷含I % FBS的PBS混匀。随后，在4°C，以220g离心3 5min后，丢弃上清，加入4°C预冷的含1% FBS的PBS重悬细胞，从而获得不含任何外来标记的细胞群，进一步可加·入生理盐水调节干细胞的浓度和体积。采用流式细胞仪鉴定分析阳性细胞群的数量，结果表明阳性细胞数量为3.5% (图2.C)，识别、纯化的干细胞纯度为96.8% (图2.D)。在分析前，添加碘化丙碇(PI)来排除分析中的死细胞。结果:采用本发明所述方法能够从骨髓、脐带血中识别、纯化出干细胞(图2)。实施例3、肝癌组织中肝癌干细胞的识别及其纯化组织制备:制备了来自成体动物的肝癌组织，组织经PBS缓冲液清洗，清洗3次，每次3 5min。材料:同实施例1，其中TRITC标记的SJ凝集素(T-SJ)购自Sigma。方法:a)无菌条件下获得新鲜肝癌组织转入无菌培养皿中后，用无菌眼科剪剪切组织为小碎块，再转入盛有胶原酶/胰蛋白酶份散酶消化液的50ml离心管中，在37°C，IOOrpm消化45min 60min后，加入4°C预冷的含 10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的DMEM/F12K培养基终止反应，再用一次性注射器将经消化的组织块吹打成单细胞悬液，之后，在40C，以180g离心3 5_，弃上清后加入4°C预冷的含2% FBS的PBS，轻轻混匀，经200目筛网过滤入另一个50ml离心管中，加入0.2%氯化钠裂解红细胞，作用时间为30second Imm,再加入1.6%氯化钠恢复溶液至等渗,之后在4°C,以180g离心3 5min,弃上清后加入4°C预冷含2% FBS的PBS混匀，用血球计数仪计数细胞数量，细胞被等分为两份，一份加入T-SJ，凝集素浓度为0.03mg/ml，一份加入等体积过量的同型对照，两份细胞均在4°C条件下避光孵育100mm，之后，在4°C，以180g离心3 5min后，丢弃上清，加入4°C预冷的含2% FBS的PBS重悬细胞，流式细胞仪分选T-SJ+细胞群，纯化的干细胞纯度为85%。在分析前，添加碘化丙碇(PI)来排除分析中的死细胞。b) 4%多聚甲醛溶液固定细胞30 40mim，室温放置40min 60min后，再依次经抗原修复(55°C 75°C,30min 80min)、室温冷却(30min 60min)后加入透膜缓冲液与固定细胞孵育，孵育时间为20 40min，之后加入BSA封闭(室温，30min 60min)，PBS洗去剩余未结合BSA之后，用抗CD90抗体与固定细胞进行孵育，4°C过夜孵育，再用PBS洗去未结合抗体，之后加入FITC- 二抗及DAPI，室温孵育30min 120min后，再用PBS洗去未结合抗体及DAPI，室温干燥后封片。激光共聚焦显微镜检测，检测到阳性细胞的数量为一个以上。结果:采用本发明的方法能够从肝癌组织中识别干细胞并进一步可对其进行纯化(图 3)。实施例4、识别、纯化肝干细胞和肺干细胞的试剂盒及其应用方法所述试剂盒包括:I)细胞预处理试剂A:氯化铵(IX);2)识别、纯化试剂B:明胶结合的PT和RC ；3)容器:用于盛放I)、2)两种溶液的圆形试剂瓶；所述试剂盒还包括洗脱糖N-乙酰葡糖胺、半乳糖试剂。其他实验材料:同实施例1。应用方法:a)加入等体积的NH4C1裂解液(溶液A)与细胞群混匀，室温放置2 3min，在40C，以200g离心3 5min，弃上清后加入Iml 4°C预冷含2% FBS的PBS重悬细胞沉淀，之后用血球计数仪计数细胞数量，细胞被等分为两份，一份加入明胶结合的凝集素，其中凝集素的浓度为4.8mg/ml，在37°C条件下静置30 45`min，之后，取下层细胞沉淀，识别、纯化的细胞群可进一步用N-乙酰葡糖胺、半乳糖两种洗脱糖把凝集素结合物从细胞膜上洗脱下来，在4°C，以220g离心2 3min，弃上清后加入4°C预冷含1% FBS的PBS混匀。随后，在4°C，以220g离心3 5min后，丢弃上清，加入4°C预冷的含I % FBS的PBS重悬细胞，从而获得不含任何外来标记的细胞群，进一步可加入生理盐水调节干细胞的浓度和体积。采用流式细胞仪鉴定分析阳性细胞群的数量，结果表明阳性细胞数量分别为2.6% (图4.B)、4.3% (图4.8’)，纯化的肝干细胞和肺干细胞纯度分别为80%、89%。在分析前，添加碘化丙碇(PD来排除分析中的死细胞。b) 4%多聚甲醛溶液固定细胞15 30mim，室温放置30min 60min后，再依次经抗原修复(55°C 75°C,30min 80min)、室温冷却(30min 60min)后加入透膜缓冲液与固定细胞孵育，孵育时间为20 40min，之后加入BSA封闭(室温，30min 60min)，PBS洗去剩余未结合BSA之后，用抗-Alb抗体、抗-c-Kit抗体分别与固定含肝干细胞、肺干细胞的载玻片进行孵育，4°C孵育过夜后，再用PBS洗去未结合抗体，含肝干细胞的载玻片加入对应的凝集素、TRITC- 二抗及DAPI，含肺干细胞的载玻片加入对应的凝集素、FITC- 二抗及DAPI，均在室温孵育30min 120min后，再用PBS洗去未结合抗体及DAPI，室温干燥后封片。激光共聚焦显微镜检测，检测到阳性细胞的数量为一个以上。结果:采用本发明试剂盒能够从混合细胞群中识别肝干细胞和肺干细胞并进一步可对其进行纯化(图4)。实施例5、识别、纯化心脏干细胞的试剂盒及其应用方法所述试剂盒包括:I)细胞预处理试剂A:0.2%氯化钠；2)识别、纯化试剂B =FITC-SJ凝集素；3)容器:用于盛放I)、2)两种溶液的方形试剂瓶；
所述试剂盒还包括洗脱糖N-乙酰葡糖胺试剂。其他实验材料:同实施例1。应用方法:a)加入0.2%氯化钠(溶液A)与细胞群混匀，室温放置30second Imin后加入
1.6%氯化钠恢复溶液至等渗,在4°C,以200g离心3 5min,弃上清后加入Iml 4°C预冷含2% FBS的PBS重悬细胞沉淀，之后用血球计数仪计数细胞数量，细胞被等分为两份，一份加入凝集素，其中，凝集素的浓度为7.6mg/ml，一份加入等体积的过量同型对照，两份细胞在16°C条件下均避光孵育45 60min，之后，在4°C，以200g离心3 5mm后，丢弃上清，加入4°C预冷的PBS重悬细胞，流式细胞仪分选凝集素阳性细胞群，纯化的干细胞纯度为89%。在分析前，添加碘化丙碇(PD来排除分析中的死细胞。收集所述干细胞进一步加入洗脱糖N-Z酰葡糖胺把所述凝集素结合物从所述细胞群中洗脱，从而获得不带任何外来标记的细胞样品，其中，可进一步加入生理盐水以调节样品的体积和浓度。b) 4%多聚甲醛溶液固定细胞15 30mim，室温放置30min 60min后，再依次经抗原修复(55°C 75°C,30min 80min)、室温冷却(30min 60min)后加入透膜缓冲液与固定细胞孵育，孵育时间为30 60min，之后BSA封闭(室温，30min 60min)，PBS洗去剩余未结合BSA之后，用抗Nkx2.5抗体与固定细胞进行孵育，4°C孵育过夜，再用PBS洗去未结合的抗体，再加入TRITC- 二抗及DAPI室温孵育60min 120min后，再用PBS洗去未结合抗体及DAPI，室温干燥后封片。激光共聚焦显微镜检测，检测到阳性细胞的数量为一个以上。结果:采用本发明所述试剂盒能够从混合细胞群中识别心脏干细胞并进一步可对其进行纯化(图5)。工业实用性 如上所述，依照本发明的方法、试剂盒，可以用一种简单、快速且经济的方法，一方面准确且有效地识别出成体干细胞，另一方面可以高同收率地纯化成体干细胞，而由此得到的含细胞液体无需随后繁琐的细胞悬液制备过程，可直接进行深低温保藏，且所述含干细胞的样品可不带任何外来标记，以便其用于基础研究和医疗应用相关的产业，如干细胞自我更新机理及相关技术研究、干细胞用于治疗、修复受损或病变组织、干细胞移植技术领域、免疫治疗领域以及药物筛选等。
权利要求
1.集素用于识别、纯化干细胞的方法，其特征在于，其包括: (1)在使所述细胞群与细胞预处理试剂预先接触条件下，使样品接触一种凝集素，后者含有:(a)至少一种凝集素，其可识别糖蛋白和/或糖脂糖链末端特异位点，该凝集素与(b)至少一种结合物进行直接或间接连接；和 (2)将与所述凝集素结合物结合的细胞群从所述样品中分离，获得富含干细胞的样品，其中，所述细胞上存在与所述凝集素特异亲和性的受体表明它们是干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，可通过加入洗脱糖的方法把凝集素结合物从所述细胞群上洗脱，从而获得不含任何外来标记的富含干细胞的样品。
3.胞预处理过程选择采用沉淀或裂解法沉淀或裂解细胞群中的红细胞的试剂，所述试剂可选择为质量浓度为0.1 20%的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种；或可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于0.9%的生理盐水溶液的任一一种；或可选择泛影酸钠-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一种进行细胞预处理，其中，所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝集素结合物中的凝集素包括天然的或化学合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的一种或两种以上的组合，所述凝集素的浓度为0.001 40mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于120分钟，孵育温度为小于或等于38°C。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述与凝集素结合的高分子量的生物大分子的分子量在一万道尔顿(Mw)至八十万道尔顿(Mw)之间，其中所述高分子量的生物大分子可选择为牛血清白蛋白、羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含干细胞的细胞群来源于啮齿动物、人类或其他哺乳动物的成体组织、肿瘤/癌前组织、肿瘤/癌性组织、转移瘤/癌组织或其他潜在包含干细胞的一种或两种以上组织的组合，或选择来自所述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。
8.集素用于识别、纯化干细胞的试剂盒及其应用方法，其中，所述凝集素还可用于确定组织、细胞群中干细胞存在与含量，其在用于从所述细胞群中富集、提纯干细胞的用途。
9.根据权利要求8所述的用于识别、纯化干细胞的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括: 1)细胞预处理试剂A； 2)识别、纯化试剂B； 3)以及任选的容器； 其中，所述细胞预处理试剂A可选择为质量浓度为01 20%的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种；或可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于0.9%的生理盐水溶液的任一一种；细胞预处理试剂或可选择为泛影酸钠-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一种，其中，所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。
其中，识别、纯化试剂B为凝集素结合物，包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的一种或两种以上的组合，其中所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种，所述凝集素的浓度为·0.0Ol 40mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于120分钟，孵育温度为小于或等于 38。。。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述含干细胞的细胞群是啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的正常成体和或病变、肿瘤、癌前、癌性、癌转移组织，或来自所述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。
11.根据权利要求1或9中任一权利要求所述，其中，随后可选择采用荧光活化细胞分选法用于鉴定和分选结合凝集素结合化合物的细胞群或选择沉淀法分离结合凝集素的所述细胞群，进一步，分离的所述干细胞，其包含细胞膜上的可与凝集素结合的受体。
12.根据权利要求1或9中任一权利要求的方法、试剂盒获得的纯化的干细胞，其特征在于，通过加入洗脱糖的方法把所述凝集素结合物从所述细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何外来标记物。
13.根据权利要求1、10、11或12中任一权利要求所述，其中所述识别、纯化的干细胞包括全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、成体干细胞、肿瘤干细胞、癌干细胞，进一步，其与已知干细胞标志物接触。
14.根据权利要求1或9任一权利要求所述，获得的干细胞还可加入生理盐水、PBS缓冲液、HBSS缓冲液以 调整干细胞的浓度和体积。
15.根据权利要求8所述的试剂盒应用方法，其特征在于，其应用方法包括以下步骤: (1)所述细胞样本与细胞预处理试剂A接触:如加入红细胞沉淀剂，选择取上清；如力口入红细胞裂解液，选择离心后丢弃上清取细胞沉淀； (2)使经过步骤(I)的所述细胞群与所述识别、纯化试剂B接触，所述凝集素的浓度为·0.001 40mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于120分钟，孵育温度为小于或等于 38 0C ； (3)分离获得凝集素阳性的细胞群:可选择采用荧光活化细胞分选、磁珠分选法或静置沉淀法； (4)加入洗脱糖把所述凝集素结合物从经步骤(3)获得的所述细胞上洗脱，从而使得获得的干细胞不带任何 外来标记物，进一步，获得的干细胞还可加入生理盐水、PBS缓冲液、HBSS缓冲液以调整干细胞的浓度和体积。
全文摘要
本发明属于生物技术、干细胞、肿瘤学领域，公开了一种识别、纯化干细胞的方法、试剂盒及其应用方法，更具体而言，本发明涉及采用新的标志物用于从啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的样品中识别、纯化干细胞的方法、及相应的识别、纯化干细胞的试剂盒及其用途，本发明所公开的方法及试剂盒可有效且精准的用于从所述源自人类或其他哺乳动物的细胞群中识别、纯化出干细胞，进一步，所述纯化后含干细胞的样品可不带任何外来标记，以便于基础研究和医疗应用，同时可通过加入常规缓冲液用于调节其浓度和体积。本发明所述的试剂盒具有使用简捷、经济、可工业化生产、实用有效的优点。本发明还涉及获得的干细胞及它们在诸如研究或治疗中的广泛用途。
文档编号C12N5/071GK103087980SQ20121044011
公开日2013年5月8日 申请日期2012年10月26日 优先权日2011年10月28日
发明者李福生, 卢磊磊, 卢淼淼, 卢晶晶 申请人:卢磊磊, 李福生