专利名称：适用于猪品种分类的猪微卫星dna标记的制作方法
技术领域：
本发明属于猪的分子生物学技术领域，具体涉及猪的微卫星DNA标记技术领域。
微卫星DNA是一类以1-6个碱基为核心顺序构成的串联重复顺序。其中尤以二核苷酸重复单位构成的为最多。微卫星DNA的主要特点是(1)数目多。据估计在真核生物基因组中每6Kb就会有1个微卫星位点(Beckmann等，《Gennomics》，1992，12卷，281-288页)，猪基因组中仅ACTG重复的微卫星就有65000-100000个；(2)分布广且均匀。微卫星DNA在基因组中是均匀分布的。Winter等(1992)的研究表明，除着丝粒及端粒的少数区域外，染色体的其他区域均广泛分布有微卫星位点；(3)多态信息含量丰富。即各位点等位基因一般较多；(4)易于进行自动化和半自动化检测。因此，微卫星DNA标记是目前用于畜禽QTL定位，遗传多样性评估的首选分子标记。如猪的遗传图谱的绝大多数标记为微卫星标记，联合国粮农组织和国际动物遗传研究会推荐的用于国际上猪遗传多样性评估的27个标记是微卫星标记，第一个用于家禽育种的分子标记专利也是微卫星标记(柳松，《国外畜牧兽医科技》1996，2期，24页)。
猪的微卫星DNA研究起步于90年代初期，但进展十分迅速。至今在猪基因组中已找到的近2000个标记中，绝大多数为微卫星标记，与此同时，猪微卫星DNA在QTL定位和遗传多样性评估中的应用研究也迅速铺开，有关猪微卫星标记的专利争夺正逐步展开。但是，我国猪微卫星的研究仍十分有限，仅极少数实验室开始了有关工作，且研究工作很不系统。鉴于猪微卫星数目多，还有大量的未被发现，且它们具有重要的理论和应用价值，特别是我国大量的优良地方猪种中还可能存在特有的微卫星位点和大量的微卫星等位基因。因此，在我国开展猪的微卫星的分离克隆、鉴定和应用研究，开发具有我国知识产权的微卫星标记显得十分迫切和必要。
本发明的目的在于分离、鉴定新的适用于猪品种分类的猪的微卫星标记，建立猪的微卫星DNA的分离、鉴定及筛选适用于猪品种分类的分子标记的方法。
本发明通过以下技术方案实现一种适用于猪品种分类的猪的微卫星标记方法，其步骤包括，构建猪的基因组文库，猪微卫星文库筛选，微卫星顺序测定，微卫星克隆和猪的品种分类，其特征在于，所述的三个微卫星标记的编号分别为HUA01，HUA02，HUA03，其DNA的顺序分别是HUA01TAATGTGGAGGAGTCAGTCTCTGAAAATTTCTTCCAGTGCATAACTATAAGTACCTGGGACTTGTAGTATGCTTCATAAATGAACAGGCTTACCTCGATTTCATATTATTTTAAATGAATGTCCGTCTGCATGAGTCATACTCTGTGTATGTGTGTGTATGTGTGTGTGGTGGGTTTCTGTTCAGTTGTTAAGTGCAGGATATTTAGTCGGTGGAAAAGTTGCTGGTAATGGTCAAAAGGGTACCCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGGTCATAGCTGTTCCTGTGTGAAATTGTTATCGCTCACAATTCACACAACATACGAGCCCGGAGATAAAGTGTAAAGCCTGGGTGCCTAATGGGTAGCTAACTCACATTAATTGCGTGCGTTCACTGCCCGTTTCCAGTCGGGAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCACGTGCGGGGAGAGGCGGTTTCGTATTGGCGCCATGGTGGTTTTCTTTTACCATTTGCGGGCACACTGATTTCCTTACCGCTGGCCTTGGTGTTCAGAAGTGTCCCGTGGTTTCCCACAGTTGAATCCTTTTTTGGGTCCGAACGGAHAU02GAGGATCCCCCTGGTGATACCCAGGTACCCCTGGTTCCTCAGGTCTGTGGGGTACAGGAAGTTGCTGGGGCTCTGGAGAGTAGAGGGGGCACAACCCAGAACTGGACTGATTTCTGCGAGAATTATGTCCTAGACAATTCATAAGAACAGAGAACCCCAATGGCAGTTGCTTCTCCATTTACGTGCCCCCACCTTCCTAGCATATCAGTTGCTATTGTGTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATTTTCCCTTGTCTCTCTGGACCTGTAATATATTTCTAGCGCAGGATTCTTACTCAGGTHAU03AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCTGGTGATGCCCAGGTCCCCCTGGATCCCCAGGACTGTGGGGTACAGGAAGTGGCTGGGGCTCTGGAGAGTAGAGGGGGCACAACCCAGAAGCTGGACTGATTTCTGCGAGAATTATGTCCTAGACAATTCATAAGAACAGACAACCCCAATGGCAGTTGCTTCTCCATTTACGTGCCCCCACCTTCCTAGCCTATCAGTGGCTATGGTGTAGTTGTGTGTGTGTGTTGTTGTGTAATTTCCCCTGGTCTCCCTGGAACCTGTTATATATTCCTACGCCAGAATCCTACTCCAGGTTAATTTGTTCTTGAATAAATTTTGGGCCACCCCTTGAATCCTTCAAAATTATGTTCCCTTAGGGGTT根据上述的三个猪微卫星标记HUA01，HUA02，HUA03设计了三个位点的引物，该引物的顺序为PL-015’-GAATGTCCGTCTGCATGAGTC-3’PR-015’-TCACACAGGAACAGCTATGACC-3’PL-025’-CCACCTTCCTAGCATATCAGTTG-3’PR-025’-CCTGAGTAAGAATCCTGCGCTAG-3’PL-035’-CCTATCAGTGGCTATGGTGTAGTT-3’PR-035’-GGAGTAGGATTCTGGCGTAGGAAT-3’本发明的具体步骤是(1)猪基因组文库的构建实验所用血样均采自江苏国营常熟畜禽良种场的二花脸猪(太湖猪的一个类群)，先后构建了两个适用于微卫星筛选的猪部分基因组文库。即猪基因组部分小插入片段M13mp18文库和pBluescriptKS+文库。
(2)(2)猪微卫星的文库筛选将铺有重组噬菌体的转染平板真空转膜至尼龙膜上(M13mp18文库筛选)或重组菌在尼龙膜上原位裂解(pBluscriptKS+文库筛选)，采用[r-32p]ATP标记寡聚核苷酸探针(TG)10的5’末端，与制备好的尼龙膜在50℃杂交过夜。放射自显影后，X光片灯上观察记录结果。
(3)猪微卫星的顺序测定克隆的微卫星的顺序测定，确定了编号为HUA01，HUA02，HUA03猪微卫星标记，其DNA顺序如上所述。
(4)新克隆微卫星的特性分析1)根据顺序测定结果设计引物，引物顺序如上所论述。2)利用本室构建的猪参考家系信息，通过PCR扩增检测猪上下代个体的基因型，判断等位基因的遗传方式。3)用染色体上的荧光原位杂交技术(FISH)和杂种细胞克隆板对新克隆的位点进行染色体定位。(1)将新克隆的微卫星用于猪的品种分类1)血样采集。采集了六个猪品种的共85个不相关个体的血样，血样分别采自湖北省的黄陂外贸种猪场(杜洛克)，湖北省农科院综合试验场种猪场(大白)，湖北省农科院畜牧所猪场(湖北白、大白)，湖北省通城畜禽良种场(通城)，河南省汝南外贸种猪场(长白、大白、杜洛克)，河南省唐河外贸种猪场(杜洛克)，河南省农科院猪场(长白)，江苏省国营常熟畜禽良种场(二花脸、长白，江苏省无锡市锡山种猪场(二花脸)，宜兴种猪场(二花脸)，江阴畜禽良种场(二花脸)及南京农大江浦畜牧实验站猪场(二花脸)。(2)基因频率统计及多态信息含量(PIC)计算。(3)遗传距离计算和类平均法聚类分析UPGMA。
实施例1鉴定了3个适用于猪品种分类的新微卫星标记HAU01、HAU02、HAU03，构建了适用于微卫星筛选的猪部分基因组文库。即猪基因组部分小插入片段，采用[r-32p]ATP标记寡聚核苷酸探针(TG)10，采用放射自显影从中筛选猪的微卫星DNA。并通过顺序测定，基因数据库中比较，结合在家系中遗传规律研究和基因定位对其进行鉴定。这三个微卫星的DNA顺序分别为HAU01TAATGTGGAGGAGTCAGTCTCTGAAAATTTCTTCCAGTGCATAACTATAAGTACCTGGGACTTGTAGTATGCTTCATAAATGAACAGGCTTACCTCGATTTCATATTATTTTAAATGAATGTCCGTCTGCATGAGTCATACTCTGTGTATGTGTGTGTATGTGTGTGTGGTGGGTTTCTGTTCAGTTGTTAAGTGCAGGATATTTAGTCGGTGGAAAAGTTGCTGGTAATGGTCAAAAGGGTACCCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGGTCATAGCTGTTCCTGTGTGAAATTGTTATCGCTCACAATTCACACAACATACGAGCCCGGAGATAAAGTGTAAAGCCTGGGTGCCTAATGGGTAGCTAACTCACATTAATTGCGTGCGTTCACTGCCCGTTTCCAGTCGGGAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCACGTGCGGGGAGAGGCGGTTTCGTATTGGCGCCATGGTGGTTTTCTTTTACCATTTGCGGGCACACTGATTTCCTTACCGCTGGCCTTGGTGTTCAGAAGTGTCCCGTGGTTTCCCACAGTTGAATCCTTTTTTGGGTCCGAACGGAHAU02GAGGATCCCCCTGGTGATACCCAGGTACCCCTGGTTCCTCAGGTCTGTGGGGTACAGGAAGTTGCTGGGGCTCTGGAGAGTAGAGGGGGCACAACCCAGAACTGGACTGATTTCTGCGAGAATTATGTCCTAGACAATTCATAAGAACAGAGAACCCCAATGGCAGTTGCTTCTCCATTTACGTGCCCCCACCTTCCTAGCATATCAGTTGCTATTGTGTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATTTTCCCTTGTCTCTCTGGACCTGTAATATATTTCTAGCGCAGGATTCTTACTCAGGTHAU03AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCTGGTGATGCCCAGGTCCCCCTGGATCCCCAGGACTGTGGGGTACAGGAAGTGGCTGGGGCTCTGGAGAGTAGAGGGGGCACAACCCAGAAGCTGGACTGATTTCTGCGAGAATTATGTCCTAGACAATTCATAAGAACAGACAACCCCAATGGCAGTTGCTTCTCCATTTACGTGCCCCCACCTTCCTAGCCTATCAGTGGCTATGGTGTAGTTGTGTGTGTGTGTTGTTGTGTAATTTCCCCTGGTCTCCCTGGAACCTGTTATATATTCCTACGCCAGAATCCTACTCCAGGTTAATTTGTTCTTGAATAAATTTTGGGCCACCCCTTGAATCCTTCAAAATTATGTTCCCTTAGGGGTT在家系中遗传规律研实施例2建立了一套切实可行的从猪基因组中克隆微卫星标记的方法。采用两种便于直接分离模板测序的载体M13mp18噬菌体和pBluescriptKS+噬菌体作为载体构建了两种适用于微卫星筛选的猪基因组部分小插入片段(250-600bp)文库，通过筛选，共得到了23个含(TG)n微卫星的阳性克隆。
实施例3将上述微卫星标记用于六个猪品种(其中包括中国地方猪种、欧美商用猪种和杂交育成猪种)的品种分类，确定了3个适用猪品种分类的微卫星标记HAU01、HAU02、HAU03。六个猪品种85个血统不相关个体的群体中三个新克隆位点HAU01、HAU02、HAU03的基因频率、多态信息含量及相互间的遗传距离和聚类分析结果显示，研究克隆的这三个微卫星标记能很好地用于猪遗传关系和遗传多样性评估。
本发明的积极效果(1)分离克隆并鉴定了三个猪的微卫星标记，经在国际基因数据库中检索，证明为新的微卫星DNA标记。
(2)经将上述微卫星标记用于猪品种的群体遗传变异检测，证明这三个微卫星标记适用于猪的品种分类和遗传多样性评估，在六个猪品种85个血统不相关个体的群体中三个新克隆位点的基因频率、多态信息含量及相互间的遗传距离和聚类分析结果如表1，表2，表3和表4所示。
(3)实验方法有重要的改进一是采用了一种特殊的平端连接方式，利用限制酶阻止载体自连，使平端连接时重组率低的问题得到改善，外源片段与载体间的重组率达60％左右，明显高于对载体作去磷酸化处理及不处理载体进行的连接(分别为36.96％和10.1％)，且操作简便，成本低；二是在重组载体转染其宿主菌的条件确定时引入试验设计的思想，通过正交设计较快、较准确的得到了较高转染效率的转染因子组合；c)尝试使用了多重PCR检测猪的微卫星，提高了检测效率，降低了检测成本。
本发明的实施效果参见表1-表4和
图1所示表1.HAU01位点的等位基因频率及多态信息含量品种 个体 等位基因大小(bp)PIC数 167171173长白 12 0.417 0.500 0.083 0.476大白 14 0.536 0.393 0.071 0.460杜洛克16 0.344 0.438 0.219 0.567湖北白80.313 0.625 0.063 0.427二花脸19 0.316 0.105 0.579 0.477通城 16 0.375 0.125 0.500 0.511表2.HAU02位点的等位基因频率及多态信息含量品种个体 等位基因大小(bp) PIC数 106108112114长白 12 0.125 0.667 0.167 0.042 0.469大白 14 0.107 0.429 0.357 0.107 0.604杜洛克 16 0.250 0.250 0.406 0.094 0.647湖北白 8 0.063 0.500 0.313 0.125 0.570二花脸 19 0.000 0.500 0.395 0.105 0.496通城 16 0.000 0.625 0.250 0.125 0.468表3.HAU03位点的等位基因频率及多态信息含量品种个体等位基因大小(bp)PIC数 101 103长白 12 0.417 0.583 0.368大白 14 0.321 0.679 0.341杜洛克 16 0.438 0.563 0.370湖北白 8 0.375 0.625 0.359二花脸 19 0.684 0.316 0.339通城 16 0.719 0.281 0.363表4六品种猪相之间的遗传距离测定
附图及其说明
图1，是本发明涉及的六品种猪的UPGMA聚类图由上述附图及表1-4可以看出，由本发明的三个微卫星信息所得到的遗传距离和聚类分析结果均能很好地反映这六品种猪的实际状况。这六个猪品种中，长白猪和大白猪为欧洲猪种，湖北白猪为我国自主育成的新品种，其中含有长白猪的血缘。杜洛克猪为美国猪种，二花脸猪和通城猪为中国地方猪种。由
图1可见，长白猪与湖北白猪首先聚在一起，再与大白猪聚在一起，然后与杜洛克猪相聚。而二花脸猪与通城猪首先聚在一起，再与上述四品种猪相聚，形成明显的二个分枝。由此可见，本发明克隆的这三个微卫星标记能很好地用于猪的品种分类。
权利要求
1.一种适用于猪品种分类的猪微卫星标记方法，其步骤包括，构建猪的基因组文库，猪微卫星文库筛选，微卫星顺序测定，微卫星克隆和猪的品种分类，其特征在于，所述的三个微卫星标记的编号分别为HUA01，HUA02，HUA03，其DNA的顺序分别是HUA01TAATGTGGAGGAGTCAGTCTCTGAAAATTTCTTCCAGTGCATAACTATAAGTACCTGGGACTTGTAGTATGCTTCATAAATGAACAGGCTTACCTCGATTTCATATTATTTTAAATGAATGTCCGTCTGCATGAGTCATACTCTGTGTATGTGTGTGTATGTGTGTGTGGTGGGTTTCTGTTCAGTTGTTAAGTGCAGGATATTTAGTCGGTGGAAAAGTTGCTGGTAATGGTCAAAAGGGTACCCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGGTCATAGCTGTTCCTGTGTGAAATTGTTATCGCTCACAATTCACACAACATACGAGCCCGGAGATAAAGTGTAAAGCCTGGGTGCCTAATGGGTAGCTAACTCACATTAATTGCGTGCGTTCACTGCCCGTTTCCAGTCGGGAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCACGTGCGGGGAGAGGCGGTTTCGTATTGGCGCCATGGTGGTTTTCTTTTACCATTTGCGGGCACACTGATTTCCTTACCGCTGGCCTTGGTGTTCAGAAGTGTCCCGTGGTTTCCCACAGTTGAATCCTTTTTTGGGTCCGAACGGAHAU02GAGGATCCCCCTGGTGATACCCAGGTACCCCTGGTTCCTCAGGTCTGTGGGGTACAGGAAGTTGCTGGGGCTCTGGAGAGTAGAGGGGGCACAACCCAGAACTGGACTGATTTCTGCGAGAATTATGTCCTAGACAATTCATAAGAACAGAGAACCCCAATGGCAGTTGCTTCTCCATTTACGTGCCCCCACCTTCCTAGCATATCAGTTGCTATTGTGTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATTTTCCCTTGTCTCTCTGGACCTGTAATATATTTCTAGCGCAGGATTCTTACTCAGGTHAU03AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCTGGTGATGCCCAGGTCCCCCTGGATCCCCAGGACTGTGGGGTACAGGAAGTGGCTGGGGCTCTGGAGAGTAGAGGGGGCACAACCCAGAAGCTGGACTGATTTCTGCGAGAATTATGTCCTAGACAATTCATAAGAACAGACAACCCCAATGGCAGTTGCTTCTCCATTTACGTGCCCCCACCTTCCTAGCCTATCAGTGGCTATGGTGTAGTTGTGTGTGTGTGTTGTTGTGTAATTTCCCCTGGTCTCCCTGGAACCTGTTATATATTCCTACGCCAGAATCCTACTCCAGGTTAATTTGTTCTTGAATAAATTTTGGGCCACCCCTTGAATCCTTCAAAATTATGTTCCCTTAGGGGTT
2.根据权利要求2所述的一种适用于猪品种分类的猪微卫星标记方法，其特征在于HUA01，HUA02，HUA03三个位点的引物顺序为PL-015’-GAATGTCCGTCTGCATGAGTC-3’PR-015’-TCACACAGGAACAGCTATGACC-3’PL-025’-CCACCTTCCTAGCATATCAGTTG-3 ’PR-025’-CCTGAGTAAGAATCCTGCGCTAG-3 ’PL-035’-CCTATCAGTGGCTATGGTGTAGTT-3 ’PR-035’-GGAGTAGGATTCTGGCGTAGGAAT-全文摘要
本发明属于家畜分子生物学技术领域,具体涉及猪的微卫星DNA标记技术。一种适用于猪品种分类的猪微卫星标记方法,其步骤包括,构建猪的基因组文库,微卫星文库筛选,微卫星顺序测定,微卫星克隆和猪的品种分类。本发明的特征是,构建部分小插入片段基因组文库,分离鉴定猪新微卫星标记,筛选其中适用于猪品种分类的猪微卫星标记HAU01、HAU02、HAU03,确定了该三个微卫星标记DNA顺序,设计了三个位点的引物。本发明为猪的品种分类、亲缘鉴定和标记辅助育种提供新的分子标记。
文档编号C12N15/12GK1370834SQ0110647
公开日2002年9月25日 申请日期2001年2月15日 优先权日2001年2月15日
发明者李奎, 彭中镇, 龚炎长, 赵书红, 刘榜, 余梅, 熊统安 申请人:华中农业大学