专利名称：一种制备虾青素单体的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地涉及水解虾青素酯，获得虾青素单体的方法。
背景技术：
虾青素(3，3’ _ 二羟基-3，3 ’ _胡萝卜素_4，4’ _ 二酮酮式类胡萝卜素)是类 胡萝卜素的含氧衍生物。它具有极强的抗氧化能力，其自由基猝灭活力是胡萝卜素的 10倍，是维生素E的100-500倍。可作为天然着色剂用于水产养殖业；既具有增强免疫反 应及抗癌的活性，还可用于食品、医药、化妆品等工业。虾青素可化学合成或从天然样品中提取。利用化学手段合成虾青素时将不可避免 的引入杂质化学物质，如合成过程中产生的非天然副产物等，将降低其生物利用安全性。因 此，不能用在人类市场。天然提取法主要是从法夫酵母、雨生红球藻和虾壳废弃物中提取得 到虾青素。法夫酵母细胞合成虾青素以单体为主，但在胞内含量低，目前还难以形成生产规 模。雨生红球藻内虾青素含量较高，一般可达细胞干重的2-3% (w/w) 0但其虾青素主要以 虾青素单酯(70% )及虾青素双酯(25% )的形式存在。虾青素酯与油脂性质相近，组分复杂，纯化和检测困难。游离虾青素不仅具有极强 的抗氧化能力，还可阻止鼠胚成纤维细胞中由致癌原诱导的肿瘤细胞转移，在药物开发中 具有重要作用。将虾青素酯水解后可增加其亲水性，并通过在虾青素的羟基上连接某些基 团，使其变为水溶性分子，有利于其在制备口服药物中的应用。如虾青素双琥珀酸二钠盐可 制成口服药物，在治疗心血管病中具有很好的应用前景。目前对虾青素酯水解的方法主要 是碱皂化，其过程需要低温且条件难于控制，收率低，容易产生虾青素的多种异构体及其它 副产物。脂肪酶(E. C. 3. 1. 1. 3)能够分解三酰甘油，可专一性针对含有酯键的物质进行水 解反应，将油脂水解为游离脂肪酸和醇，还可催化酯化反应，转酯化反应及酯交换反应。脂 肪酶的水解反应是在一种非均相体系中进行的，酶(水溶性)在底物(水不溶性)和水的 界面上催化底物反应，这种特性被称为界面活性。脂肪酶具有底物特异性和反应条件温和 的优点。本发明人利用脂肪酶对雨生红球藻粗提物虾青素酯进行水解，最终得到了一种在 温和条件下进行酶解的策略，可提高雨生红球藻虾青素的收率。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的水解雨生红球藻中虾青素酯，获得虾青素单体的方 法。本发明制备虾青素单体的方法是将虾青素酯用脂肪酶水解得到游离虾青素单体。所述脂肪酶优选为碱性脂肪酶，更优选为来自Penicillium cyclopium var. albus的碱性脂肪酶。所述虾青素酯可以是来自雨生红球藻的虾青素酯，在本发明实施例中虾青素酯是 雨生红球藻粗提物油剂，其天然左旋虾青素可达5%。
可将雨生红球藻粗提物油剂经乳化剂乳化后，再用脂肪酶水解。所述乳化剂可以 是非离子型乳化剂，优选为吐温80。乳化剂的加入量以使得油剂能够充分乳化为宜。例如， 吐温80的加入量宜为雨生红球藻粗提物油剂重量的1 3倍。上述脂肪酶按照2 12U/i! g总类胡萝卜素加入，优选每微克总类胡萝卜素加入 4 10U脂肪酶。上述水解反应可以在pH6. 0 8. 0的磷酸盐缓冲液中进行，于150 200rpm、25 30°C下反应5 7小时即可。进一步可以用薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)对水解产物进行 检测鉴定。本发明提供了一种新的水解雨生红球藻中虾青素酯而得虾青素单体的方法。采用 本发明所述的方法，虾青素单体回收率达63. 2%。本方法操作简单，只需要一步反应再经提 取即得到目的产物，节省能耗，也可在一定程度上避免因长时间反应导致的虾青素损失。
图1脂肪酶水解虾青素酯的TLC检测；其中，Lanel 虾青素标准品(Sigma)； Lane2 未加酶液的反应底物；Lane3 加酶液振荡反应7h的反应产物。图2脂肪酶水解虾青素酯的HPLC检测；图2a 水解前底物的HPLC检测；其中峰2 为游离虾青素，峰8-22为虾青素酯；图2b 加酶水解7h产物的HPLC检测；其中峰6为游离 虾青素，峰16-25为虾青素酯。图3TLC法回收的游离虾青素的质谱检测。图3a 用TLC法从反应体系中回收的 游离虾青素的质谱检测；图3b 虾青素标准品(Sigma)的质谱检测。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明中涉及到的百分号“ ％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分 比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20°C时 容量的比例。实施例IPeniciIlium cyclopium var. albus碱性脂肪酶酶液的制备以 Penicillium cyclopium var. albus (CGMCC 3. 4041)碱性脂肪酶的 cDNA 为 模板，根据GenBank中该酶的基因序列(GenBank登录号为AF274320. 1)设计引物(P1 gaattcgcaactgctgacgccgct, P2 :gcggccgtcagctcagatagccaca),进行 PCR 扩增。从 PCR 产 物中回收目的条带，并连接到载体pMD18-T-Simple上(购自TaKaRa公司)；再用限制性内 切酶SnaBI和Not 1分别对pMD18-T-alip和pKIC9K进行双酶切，然后对目的片段进行回 收，用T4连接酶将其连接，得到表达质粒pPIC9K-alip。用限制性内切酶Sal I酶切载体 PIC9K-alip，然后用乙醇沉淀的方法浓缩线性化片段，电击法转化巴斯德毕赤酵母GS115 感受态细胞，转化后涂布不含组氨酸的基本培养基MD平板。平板在30°C培养2-3天后，将 长出的转化子经无菌水悬浮后稀释至105个细胞/毫升悬浮液，涂至不同G418抗性的YPD 平板，采用G418浓度梯度筛选巴斯德毕赤酵母高拷贝转化子，通过酵母菌落PCR法鉴定正 确整合的转化子，再通过摇瓶诱导培养，选取其中酶活最高的一株进行下面的产酶发酵实
将重组Penicillium cyclopium var. albus碱性脂肪酶基因的巴斯德毕赤酵母接 种于含有25ml BMGY培养基(1%酵母粉，2%蛋白胨，甘油)的250ml三角瓶中，于30°C， 180rpm摇床培养至OD6tltl为6. 0左右，再转接到装有50ml BMMY培养基(1%酵母粉，2%蛋 白胨，1. 0%甲醇，1. 34%无氨基酸酵母氮源，100mmol/l磷酸缓冲液，pH 7. 0的500ml三角 瓶中，相同培养条件继续培养，每24小时补加100%甲醇于培养基至终浓度为1.0%，诱导 表达2天。每隔一定的时间取样，测量其细胞密度(0D_)和胞外的脂肪酶的酶活。当酶活 达到170U/ml时不再上升时，收集发酵液，8000rpm，4°C，离心lOmin，取上清，4°C保存，用于 以下的酶解反应。实施例2乳化物制备及酶解反应条件优化 取0. Ig雨生红球藻虾青素粗提物油剂(天然左旋虾青素5%油剂，购自荆州天然 虾青素有限公司)于研钵中，加入0.5 5倍质量的吐温80，研磨乳化，并加0. IM磷酸钠缓 冲液(pH5. 0 8. 0)定容至IOml ；以每微克总类胡萝卜素加入2 12U脂肪酶的量加入乳 化物(Iml)及酶，再加入0. 1M，pH5. 0 8. 0的磷酸钠缓冲液至总体积IOml ；30°C,180rpm 振荡反应，每隔l_2h取样，用TLC及HPLC检测，反应至12h停止。结果表明，吐温80按照雨生红球藻粗提物油剂重量的1 3倍加入可有效乳化， 但由于TweenSO量多会增加提取液丙酮的用量，出于经济因素考虑，优选TweenSO量为雨生 红球藻粗提物油剂重量的1倍。脂肪酶按照2 12U/y g总类胡萝卜素加入可以有效水 解，优选每微克总类胡萝卜素加入4 IOU脂肪酶，水解5 7小时即可。水解反应可在 pH6. 0 8. 0的磷酸盐缓冲液中进行，其中pH7. 0的条件下反应较佳。实施例3虾青素酯的水解取0. Ig雨生红球藻虾青素粗提物油剂(购自荆州天然虾青素有限公司)于研钵 中，加入1倍质量的吐温80，研磨乳化，并加0. IM磷酸钠缓冲液(pH7. 0)定容至IOml ；以每 微克总类胡萝卜素加入4U脂肪酶的量加入乳化物(Iml)及酶，再加入0. 1M，pH7. 0的磷酸 钠缓冲液至总体积IOml ；28°C，150rpm振荡反应7小时，虾青素得率为63. 2%。反应结束 后，加入与样品同体积的丙酮，室温条件下用漩涡振荡器振荡30s，再加入等体积的正己烷， 上述同样方法振荡30s，12000rpm，离心lmin，取上清用于TLC和HPLC检测。实施例4虾青素酯的水解取0. Ig雨生红球藻虾青素粗提物油剂(购自荆州天然虾青素有限公司)于研钵 中，加入1倍质量的吐温80，研磨乳化，并加0. IM磷酸钠缓冲液(pH7. 0)定容至IOml ；以每 微克总类胡萝卜素加入8U脂肪酶的量加入乳化物(Iml)及酶，再加入0. 1M，pH7. 0的磷酸 钠缓冲液至总体积IOml ；28°C，180rpm振荡反应6小时。虾青素得率为63. 0%。反应结束 后，加入与样品同体积的丙酮，室温条件下用漩涡振荡器振荡30s，再加入等体积的正己烷， 上述同样方法振荡30s，12000rpm，离心lmin，取上清用于TLC和HPLC检测。实施例5虾青素酯的水解取0. Ig雨生红球藻虾青素粗提物油剂(购自荆州天然虾青素有限公司)于研钵 中，加入1倍质量的吐温80，研磨乳化，并加0. IM磷酸钠缓冲液(pH7. 0)定容至IOml ；以每 微克总类胡萝卜素加入12U脂肪酶的量加入乳化物(Iml)及酶，再加入0. 1Μ，ρΗ7. 0的磷酸 钠缓冲液至总体积IOml ；28°C，200rpm振荡反应5小时。虾青素得率为63. 1%。反应结束
5后，加入与样品同体积的丙酮，室温条件下用漩涡振荡器振荡30s，再加入等体积的正己烷， 上述同样方法振荡30s，12000rpm，，离心lmin，取上清用于TLC和HPLC检测。实施例6产物的TLC、HPLC及MS检测产物用等体积的丙酮和正己烷的混合液进行提取，12000rpm，离心lmin，取上清， 用于TLC和HPLC检测(l)TLC检测方法采用5%柠檬酸对硅胶板进行喷雾酸化处理，70°C干燥lh ；选用正己烷和丙酮 (4 1)为展层剂，点样后在层析缸中展层15min。虾青素单体及虾青素酯具有鲜艳的红色， 易于观察判断；另取标准虾青素样品(购自Sigma公司)10mg，定溶于100ml 二氯甲烷和甲 醇的混合液(1 4)中，作为正对照。如图1所示，大部分虾青素酯被降解为虾青素单体。(2) HPLC 检测方法色谱柱反相C18柱(北京创新通恒)，内径4. 6mm,长度250mm ；流动相乙腈、乙 酸乙酯和水(63 30 7)，流速lml/min，检测波长470nm，柱温35°C。配置虾青素标准品 (Sigma)制作标准曲线。其结果见图2。可见，加酶反应后，虾青素酯含量变少，游离虾青素
含量升高。虾青素得率为反应后所得虾青素单体的质量与反应前加入反应体系中的虾青素 酯的质量的比值。(3) MS 检测用丙酮和正己烷提取酶解后的产物，取上层吹氮浓缩，TLC分离。根据标准品迁移 位置回收产物中的单体条带，丙酮洗脱后，12000rpm,离心lOmin，取上层，0. 45 u m滤膜过 滤，进行质谱分析(LCQ Deca XP Thermo Finngian，San Jose，CA)。质谱条件为喷射电压 4. 5kv，毛细管温度300°C，正离子检测，质谱仪在m/z = 400-800的范围内进行扫描。其检 测结果见图3。回收的游离虾青素样品分子量为596. 7 (M-1)，与虾青素标准品的分子量一 致，证明是同一物质。
权利要求
一种制备虾青素单体的方法，其是将虾青素酯用脂肪酶水解得到游离虾青素单体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶为碱性脂肪酶。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶来自Penicilliumcyclopium var. albuso
4.如权利要求1 3任一项所述的方法，其特征在于，所述虾青素酯来自雨生红球藻。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述将雨生红球藻粗提物油剂经乳化剂乳 化后，用脂肪酶水解。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述乳化剂为吐温80。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述吐温80的加入量为雨生红球藻粗提物 油剂重量的1 3倍。
8.如权利要求1 3任一项所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶按照2 12U/μ g总 类胡萝卜素加入。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述水解反应在pH6.0 8. 0的磷酸盐缓冲 液中进行，于150 200rpm、25 30°C下反应5 7小时。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，将雨生红球藻粗提物油剂与吐温80按照重 量比1 1 3混合，充分乳化，加入0. 1ΜρΗ6. 0 8. 0的磷酸盐缓冲液，按照每微克总类 胡萝卜素加入4 IOU总类胡萝卜素，于150 200rpm、25 30°C下反应5 7小时。全文摘要
本发明提供了一种新的制备虾青素单体的方法，其是将虾青素酯用脂肪酶水解得到游离虾青素单体。采用该方法虾青素单体回收率达63.2％。本方法操作简单，只需要一步反应再经提取即得到目的产物，节省能耗，也可在一定程度上避免虾青素在长时间反应过程中的损失。本发明为酶法从雨生红球藻粗提物中获取虾青素单体的工业化应用奠定了基础。
文档编号C12P23/00GK101892281SQ20101023998
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者关国华, 关菲菲, 李颖, 王珍芳, 王贵利, 赵莹莹 申请人:中国农业大学