专利名称：利用酶生产虾青素的方法
技术领域：
本发明涉及一种虾青素的生产方法，特别是涉及一种利用酶生产虾青素的方法。
背景技术：
虾青素是一种萜烯类不饱和化合物，化学名称为3，3- 二羟基-4，4- 二酮基， 胡萝卜素，分子式为C4tlH52O4，相对分子量为596. 86，不溶于水，具脂溶性。虾青素广泛
存在于生物体内，在大马哈鱼的肉质中，虾青素占类胡萝卜素的70%左右，有的甚至高达99. 8%。由于虾青素分子结构中的共轭双键，以及共轭双键末端的不饱和酮基和羟基，能吸引自由基从而具有抗氧化作用，虾青素是目前天然抗氧化剂中，抗氧化能力最强的化合物之一，其抗氧能力比￠-胡萝卜素强117倍，比维生素E强80倍。雨生红球·藻(Haematococcus pluvialis)是一种淡水单细胞绿藻，隶属绿藻门团藻目红球藻科红球藻属。该藻的生长分为明显的绿色游动细胞和红色不动孢子两个阶段。在弱光、氮磷丰富的环境中主要以绿色的游动细胞形式存在，在该过程中雨生红球藻生长旺盛，细胞内含有少量虾青素；而在高光照、高温、高盐和营养盐饥饿条件下，则以不动抱子(厚壁抱子)形式存在，此时，藻细胞中常因含有大量虾青素而呈现红色。目前，国内外主要利用红法夫酵母为菌种发酵生产虾青素。红法夫酵母以葡萄糖、纤维二糖为碳源；硫酸铵为氮源；由于其为兼性好氧，间断通气；最适培养温度为20 220C ;最适pH值为5. 0 ;供氧速率要高于30mmol/h ;红法夫酵母对其培养条件较为苛刻，比如供氧速率低于30mmol/h时，细胞的产量和虾青素的产量都明显下降。氧气浓度达到30mmol/h时，再继续提高通气量，虾青素的产量提高不大。利用红法夫酵母为菌种发酵生产虾青素过程中，红法夫酵母易被外界霉菌污染，所以在发酵过程中需要在无菌环境，同时红法夫酵母为好氧菌，发酵需要通入无菌氧，大大提高成本；发酵过程中要严格控制温度，PH值以及供氧速率，任何一个发酵条件都直接影响虾青素的生产效率；到发酵后期菌体会产生有毒副产物，对虾青素后续净化提纯带来困难，同时也污染环境。
发明内容
基于此，本发明提供一种利用酶生产虾青素的方法。解决上述技术问题的具体技术方案如下一种利用酶生产虾青素的方法，包括以下步骤(I)康氏木霉的培养将康氏木霉孢子悬浮液接入PDY液体培养基中，培养1. 5-2. 5d，离心去上清液，得康氏木霉菌菌泥；(2)康氏木霉发酵物的培养取步骤(I)所得的康氏木霉菌菌泥接入固体发酵培养基中，先于30-32°C下培养29-31h，后于26-28°C下培养75-90h，离心去上清液，得康氏木霉发酵物；通过调控发酵条件，使所得的康氏木霉发酵物中富含纤维素酶；(3)雨生红球藻的扩培将雨生红球藻接入BBM培养基并置于封闭式光生物反应器中，通空气培养1. 5-2. 5d,离心取雨生红球藻藻泥；(4)富集虾青素的雨生红球藻藻粉的制备将步骤(3)所得的雨生红球藻藻泥接A BBM培养基中，通入CO2，通气量为0. 5 1. 5L/(L *min)并于32_35°C培养2_3d，离心去上清液，冷冻干燥得富集虾青素的雨生红球藻藻粉；通过调控光照和温度培养富集虾青素雨生红球藻；(5)虾青素干粉的制备将步骤(2)所得的康氏木霉发酵物和步骤(4)所得的富集虾青素的雨生红球藻藻粉混合，匀质，离心，过滤取固体相，冷冻干燥，得虾青素干粉；由于康氏木霉发酵物中富含纤维素酶可降解雨生红球藻的细胞壁，而均质可进一步使藻细胞破碎，释放虾青素，由于虾青素不溶于水，所以离心后虾青素存在于非溶解相，即固体相，该固体相经干燥后，即得虾青素干粉。(6)虾青素的萃取用玉米油萃取步骤(5)所得的富含虾青素的干粉，即可得虾青素；由于虾青素为脂溶性的，用玉米油可有效萃取虾青素。在其中一些实施例中，步骤(1)所述的PDY液体培养基的组成及重量份配比如下马铃薯18-22wt%，葡萄糖1. 5-2. 5wt%，酵母膏0. 8-1. 2wt%，余量为水。在其中一些实施例中，步骤(1)所述的康氏木霉孢子悬浮液接入量为康氏木霉孢子悬浮液与PDY液体培养基的重量份配比为1:9-11，所述康氏木霉孢子悬浮液中康氏木霉孢子的浓度为0. 04-0. 06mg/L。在其中一些实施例中，步骤(1)所述的培养的条件为温度23-27 °C、转速120_150r/mino在其中 一些实施例中，步骤(2)所述的康氏木霉囷泥的接入量为康氏木霉囷泥与固体发酵培养基的重量份配比为1:490-560。在其中一些实施例中，步骤(2)所述的固体发酵培养基的组成及重量份配如下豆柏0. 9-1.1份、稻草11-13份、麸皮9-11份、羧甲基纤维素钠0. 75-0. 85份、吐温-800. 009-0. 011 份、(NH4) 2S040 . 07-0 . 09 份、水 28-30 份。在其中一些实施例中，步骤(3)所述的封闭式光生物反应器的参数为温度25-28 °C，光照 55-65 u mo 1 m 2 s 1 在其中一些实施例中，步骤(3)所述的BBM培养基的组成及重量份配比如下硝酸钠245-255份；磷酸二氢钾170-180份；磷酸氢二钾70-80份；七水硫酸镁70-80份；二水氯化钙23-38份；氯化钠23-38份；EDTA48_53份；氢氧化钾29-33份；七水硫酸亚铁4. 8-5份；硼酸11-12份；七水硫化锌8. 5-9份；氯化锰1. 4-1. 5份；氧化钥0. 7-0. 8份；五水硫酸铜1. 5-1. 6份；六水硝酸钴0. 7-0. 8份，蒸馏水1000ml。在其中一些实施例中，步骤(3)所述的雨生红球藻的接入量为每IOOmLBBM培养基中接入雨生红球藻3-5g。在其中一些实施例中，步骤(4)所述的BBM培养基的组成及重量份配比如下七水硫酸镁70-80份，二水氯化钙23-38份，氯化钠23-38份，EDTA48-53份，氢氧化钾29-33份，七水硫酸亚铁4. 8-5份,硼酸11-12份,七水硫化锋8. 5-9份,氯化猛1. 4-1. 5份,氧化钥0. 7-0. 8份，五水硫酸铜1. 5-1. 6份，蒸馏水1000ml。在其中一些实施例中，步骤(4)所述的雨生红球藻藻泥的接入量为 每IOOmL BBM培养基中接入雨生红球藻藻泥20-25g。
本发明一种利用酶生产虾青素的方法具有以下优点和有益效果本发明可高效地获得天然虾青素，工艺简单，成本低，环境污染少，且在发酵过程中不产生有毒的副产物，后期净化提纯方法简易，适合工业化推广。
具体实施例方式本发明采用康氏木霉固体发酵制备富含纤维素酶的发酵物，通过调控光照和温度培养富集虾青素雨生红球藻，发酵物可高效分解雨生红球藻细胞壁，经均质进一步破坏细胞膜，使雨生红球藻体内富集的虾青素释放出来，离心取不溶解相，冷冻干燥，最后利用玉米油萃取，即得虾青素。以下将结合具体的实施例对本发明做进一步阐述。实施例1一种利用酶生产虾青素的方法，包括以下步骤(I)康氏木霉的培养将斜面培养基上的康氏木霉孢子用无菌水洗下,制成康氏木霉孢子的浓度为0. 05mg/L孢子悬浮液；在IOOOml的PDY培养基(该培养基含马铃薯20wt%，葡萄糖2wt%,酵母膏lwt%,余量为水,上述物质共计100wt%)中接入IOOml康氏木霉孢子悬浮液，在25°C 、120 150r/min条件下培养2d，离心去上清液，收集菌泥；(2)康氏木霉发酵物的培养将步骤(I)培养好的康氏木霉菌菌泥取IOOg接种到固体发酵培养基(该培养基含豆柏1kg、稻草12kg、麸皮10kg、CMC-NaO. 8kg、吐温-800. 01kg、(NH4)2SO4O. 08kg、水29kg)，即取IOOg步骤(I)所得的康氏木霉菌泥接入52. 89kg的固体发酵培养基中，先于30-32°C下培养30h，后于26-28°C下培养88h，离心去上清液，并用无菌水清洗离心所得固体相，得康氏木霉发酵物；(3)雨生红球藻的扩培取40g雨生红球藻接入BBM培养基(硝酸钠250mg，磷酸二氢钾175mg，磷酸氢二钾75mg，七水硫酸镁75mg，二水氯化钙25mg，氯化钠25mg，EDTA50mg，氢氧化钾31mg,七水硫酸亚铁4. 9811^,硼酸11. 42mg,七水硫化锌8. 82mg,氯化猛1. 44mg,氧化钥0. 71mg,五水硫酸铜1. 57mg,六水硝酸钴0. 75mg,蒸懼水IOOOml)并置于封闭式光生物反应器中，封闭式光生物反应器的参数为温度s-1下连续光照，同时通空气培养2d，离心取雨生红球藻藻泥；(4)富集虾青素的雨生红球藻藻粉的制备将步骤(3)所得的雨生红球藻藻泥230g接入BBM培养基(七水硫酸镁75mg，二水氯化钙25mg，氯化钠25mg，EDTA50mg,氢氧化钾31mg,七水硫酸亚铁4. 98mg,硼酸11. 42mg,七水硫化锌8. 82mg,氯化猛1. 44mg,氧化钥
0.71mg，五水硫酸铜1.57mg，蒸馏水1000ml)中，通入CO2通气量为0. 5 1. 5L/(L min)并于32-35°C培养2. 5d，得藻液，藻液经沉降、离心浓缩去上清液，冷冻干燥得富集虾青素的雨生红球藻藻粉；(5)虾青素的干粉的制备将步骤(2)所得的康氏木霉发酵物和步骤(4)所得的富集虾青素的雨生红球藻藻粉混合，匀质，离心，过滤取固体相，冷冻干燥，得虾青素的干粉；(6)虾青素的萃取用玉米油萃取步骤(5)所得的富含虾青素的干粉，即可得虾青素提取率为0. 97% 0. 98%。实施例2一种利用酶生产虾青素的方法，包括以下步骤
(I)康氏木霉的培养将斜面培养基上的康氏木霉孢子用无菌水洗下,制成康氏木霉孢子的浓度为0. 04mg/L孢子悬浮液；在IOOOml的PDY培养基(该培养基含马铃薯18wt%，葡萄糖1. 5wt%,酵母膏0. 8wt%,余量为水,上述物质共计100wt%)中接入IOOml康氏木霉孢子悬浮液，在23°C、120 150r/min条件下培养1. 5d，离心去上清液，收集菌泥；(2)康氏木霉发酵物的培养将步骤(I)培养好的康氏木霉取IOOg接种到固体发酵培养基(该培养基含豆柏0. 9kg、稻草I lkg、麸皮9kg、CMC-NaO. 75kg、吐温-800. 009kg、(NH4)2SO4O. 07kg、水28kg)，即取IOOg步骤(I)所得的康氏木霉菌泥接入49. 73kg的固体发酵培养基中，先于30-32°C下培养29h，后于26-28°C下培养76h，离心去上清液，并用无菌水清洗离心所得固体相，得康氏木霉发酵物；(3)雨生红球藻的扩培将31g雨生红球藻接入BBM培养基(硝酸钠245mg，磷酸二氢钾170mg,磷酸氢二钾70mg,七水硫酸镁70mg, 二水氯化韩23mg,氯化钠23mg份，EDTA48mg,氢氧化钾29mg,七水硫酸亚铁4. 8mg,硼酸Ilmg,七水硫化锌8. 5mg,氯化猛1. 4mg,氧化钥0. 7mg,五水硫酸铜1. 5mg,六水硝酸钴0. 7mg,,蒸懼水1000ml)并置于封闭式光生物反应器中，封闭式光生物反应器的参数为温度25°C，55iimol.m-2. s-1下连续光照，同时通空气培养1. 5d，离心取雨生红球藻藻泥；(4)富集虾青素的雨生红球藻藻粉的制备将步骤(3)所得的雨生红球藻藻泥210g接入BBM培养基(二水氯化钙23mg，氯化钠23mg份；EDTA48mg ;氢氧化钾29mg ;七水硫酸亚铁4. 8mg ;硼酸Ilmg ;七水硫化锌8. 5mg ;氯化猛L 4mg ;氧化钥0. 7mg ;五水硫酸铜1.5mg ;蒸馏水1000ml)中，通入CO2通气量为0. 8 1. 2L/(L .min)并于32_35°C培养2d，得藻液，藻液经沉降、离心浓缩去上清液，冷冻干燥得富集虾青素的雨生红球藻藻粉；所述BBM培养基中不含NaNO3 ；(5)虾青素的干粉的制备将步骤(2)所得的康氏木霉发酵物和步骤(4)所得的富集虾青素的雨生红球藻藻粉混合，匀质，离心，过滤取固体相，冷冻干燥，得虾青素的干粉；(6)虾青素的萃取 用玉米油萃取步骤(5)所得的富含虾青素的干粉，即可得虾青素提取率为0. 959T0. 96%。实施例3—种利用酶生产虾青素的方法，包括以下步骤(I)康氏木霉的培养将斜面培养基上的康氏木霉孢子用无菌水洗下，制成康氏木霉孢子的浓度为0. 06mg/L孢子悬浮液；在IOOOml的PDY培养基(该培养基含马铃薯22wt%，葡萄糖2. 5wt%,酵母膏1. 2wt%,余量为水,上述物质共计100wt%)中接入IOOml康氏木霉孢子悬浮液，在27°C、120 150r/min条件下培养1. 5d，离心去上清液，收集菌泥；(2)康氏木霉发酵物的培养将步骤(I)培养好的康氏木霉取IOOg接种到固体发酵培养基(该培养基含豆柏1. lkg、稻草13kg、麸皮11kg、CMC-NaO. 85kg、吐温-800. 011kg、(NH4)2SO4O. 09kg、水30kg)，即取IOOg步骤(I)所得的康氏木霉菌泥接入56. 05kg的固体发酵培养基中，先于30-32°C下培养31h，后于26-28°C下培养81h，离心去上清液，并用无菌水清洗离心所得固体相，得康氏木霉发酵物；(3)雨生红球藻的扩培将49g雨生红球藻接入BBM培养基(硝酸钠255mg，磷酸二氢钾180mg,磷酸氢二钾80mg,七水硫酸镁80mg, 二水氯化韩38mg,氯化钠38mg, EDTA53mg,氢氧化钾33mg,七水硫酸亚铁5mg,硼酸12mg,七水硫化锌9mg,氯化猛1. 5mg,氧化钥0.8mg,五水硫酸铜1. 6mg,六水硝酸钴0. 8mg,蒸懼水1000ml)并置于封闭式光生物反应器中，封闭式光生物反应器的参数为温度28°C，65iimol.m-2. s-1下连续光照，同时通空气培养2. 5d，离心取雨生红球藻藻泥；(4)富集虾青素的雨生红球藻藻粉的制备将步骤(3)所得的雨生红球藻藻泥248g接BBM培养基(七水硫酸镁80mg，二水氯化钙38mg，氯化钠38mg，EDTA53mg,氢氧化钾33mg,七水硫酸亚铁5mg,硼酸12mg,七水硫化锌9mg,氯化猛1. 5mg,氧化钥0. 8mg,五水硫酸铜1.6mg，蒸馏水1000ml)中，通入CO2通气量为I 1.4L/(L min)并于32-35°C培养3d，得藻液，藻液经沉降、离心浓缩去上清液，冷冻干燥得富集虾青素的雨生红球藻藻粉；所述BBM培养基中不含NaNO3 ；(5)虾青素的干粉的制备将步骤(2)所得的康氏木霉发酵物和步骤(4)所得的富集虾青素的雨生红球藻藻粉混合，匀质，离心，过滤取固体相，冷冻干燥，得虾青素的干粉；(6)虾青素的萃取用玉米油萃取步骤(5)所得的富含虾青素的干粉，即可得虾青素提取率为0. 959T0. 96%。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发 明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求
1.一种利用酶生产虾青素的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)康氏木霉的培养将康氏木霉孢子悬浮液接入PDY液体培养基中，培养1.5-2. 5d， 离心去上清液，得康氏木霉菌菌泥；(2)康氏木霉发酵物的培养取步骤(I)所得的康氏木霉菌菌泥接入固体发酵培养基中，先于30-32°C下培养29-31h，后于26-28°C下培养75-90h，离心去上清液，得康氏木霉发酵物；(3)雨生红球藻的扩培将雨生红球藻接入BBM培养基并置于封闭式光生物反应器中， 通空气培养1. 5-2. 5d，离心去上清液，得雨生红球藻藻泥；(4)富集虾青素的雨生红球藻藻粉的制备将步骤(3)所得的雨生红球藻藻泥接入BBM 培养基中，通入CO2,通气量为O. 5 1. 51/ (L -min)并于32_35°C培养2_3d，离心去上清液， 冷冻干燥得富集虾青素的雨生红球藻藻粉；(5)虾青素干粉的制备将步骤(2)所得的康氏木霉发酵物和步骤(4)所得的富集虾青素的雨生红球藻藻粉混合，匀质，离心，过滤取固体相，冷冻干燥，得虾青素干粉；(6)虾青素的萃取用玉米油萃取步骤(5)所得的富含虾青素的干粉，即可得虾青素。
2.根据权利要求1所述的酶生产虾青素的方法，其特征在于，步骤(I)所述的PDY 液体培养基的组成及重量份配比如下马铃薯18-22wt%，葡萄糖1.5-2. 5wt%，酵母膏O.8-1. 2wt%，余量为水。
3.根据权利要求1所述的酶生产虾青素的方法，其特征在于，步骤(I)所述的康氏木霉孢子悬浮液接入量为康氏木霉孢子悬浮液与PDY液体培养基的重量份配比为1:9-11，所述康氏木霉孢子悬浮液中康氏木霉孢子的浓度为O. 04-0. 06mg/L,所述的培养条件为温度 23-27°C、转速 120-150r/min。
4.根据权利要求1所述的酶生产虾青素的方法，其特征在于，步骤(2)所述的康氏木霉菌菌泥的接入量为康氏木霉菌菌泥与固体发酵培养基的重量份配比为1:490-560。
5.根据权利要求1所述的酶生产虾青素的方法，其特征在于，步骤(2)所述的固体发酵培养基的组成及重量份配如下豆柏O. 9-1.1份、稻草11-13份、麸皮9-11份、羧甲基纤维素钠 O. 75-0. 85 份、吐温-800. 009-0. 011 份、(NH4) 2S040. 07-0. 09 份、水 28-30 份。
6.根据权利要求1所述的酶生产虾青素的方法，其特征在于，步骤(3)所述的封闭式光生物反应器的参数为温度25-28°C，光照55-65 μ mo I · m_2 · s-1。
7.根据权利要求1所述的酶生产虾青素的方法，其特征在于，步骤(3)所述的BBM培养基的组成及重量份配比如下硝酸钠245-255份，磷酸二氢钾170-180份，磷酸氢二钾 70-80份，七水硫酸镁70-80份，二水氯化钙23-38份，氯化钠23-38份，EDTA48-53份，氢氧化钾29-33份，七水硫酸亚铁4. 8-5份，硼酸11-12份，七水硫化锌8. 5_9份，氯化锰1. 4-1. 5 份，氧化钥O. 7-0. 8份，五水硫酸铜1. 5-1. 6份，六水硝酸钴O. 7-0. 8份，蒸馏水IOOOml。
8.根据权利要求1所述的酶生产虾青素的方法，其特征在于，步骤(3)所述的雨生红球藻的接入量为每IOOmL BBM培养基中接入雨生红球藻3_5g。
9.根据权利要求1所述的酶生产虾青素的方法，其特征在于，步骤(4)所述的BBM培养基的组成及重量份配比如下七水硫酸镁70-80份，二水氯化钙23-38份，氯化钠23-38份， EDTA48-53份，氢氧化钾29-33份，七水硫酸亚铁4. 8-5份，硼酸11_12份，七水硫化锌8. 5-9 份，氯化锰1. 4-1. 5份，氧化钥O. 7-0. 8份，五水硫酸铜1. 5-1. 6份，蒸馏水IOOOml。
10.根据权利要求1所述的酶生产虾青素的方法，其特征在于，步骤(4)所述的雨生红球藻藻泥的接入量为每IOOmL BBM培养基中接入雨生红球藻藻泥20-25g。
全文摘要
本发明公开了一种利用酶生产虾青素的方法，包括以下步骤将康氏木霉孢子悬浮液接入9-11倍重量的PDY液体培养基中，离心取康氏木霉菌泥；取菌泥接入490-560倍重量的固体发酵培养基中，先30-32℃培养29-31h，后26-28℃培养75-90h，离心得康氏木霉发酵物；利用封闭式光生物反应器，将雨生红球藻于BBM培养基中培养2d，离心取藻泥；将藻泥接入BBM培养基中，通CO2于32-35℃培养2-3d，离心冷冻干燥得藻粉；将发酵物和藻粉匀质，离心取固体相，冷冻干燥，得虾青素干粉；用玉米油萃取干粉，即得虾青素。本发明可高效地获得天然虾青素，工艺简单，成本低，环境污染少。
文档编号C07C403/24GK103044303SQ20121055731
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者刘立国, 王倩, 刘柏楠 申请人:广州优锐生物科技有限公司