专利名称：抑制大鼠IL-1β基因表达的siRNA腺病毒载体的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种siRNA表达载体，更具体地说，涉及一种抑制大鼠IL-I β基因表 达的siRNA重组腺病毒载体的构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
白细胞介素(Interleukine)作为免疫细胞间相互作用的细胞因子，在信息传递， 激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及炎症反应中起到重要的作用。其 中，白细胞介素I(IL-I)作为一种重要的促炎性细胞因子，其生物学作用非常广泛。近年 来，越来越多的研究证明了白细胞介素1是一种应激反应中的中枢调节子，在神经内分泌 和和行为应激反应方面发挥着重要作用。白细胞介素1是第一个被证明与神经内分泌系统 (下丘脑_垂体_肾上腺轴，ΗΡΑ)调节相关的细胞因子，现已初步揭示了白细胞介素1在应 激诱导HPA中枢活动、行为过程和神经元可塑性方面发挥着重要作用，在病理条件下，白细 胞介素1基因表达量和蛋白质产量都会升高，并且在这一过程中白细胞介素1负责多种免 疫刺激引起的炎症反应。因此，白细胞介素1不仅是体内神经免疫调节和炎症反应的中枢 介质，而且在许多神经退行性疾病的病理机制中起着重要作用。神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)是一类大脑和脊髓的细胞神经元 丧失的疾病状态。近年来随着人口老龄化进程的加快，神经退行性疾病的发病率不断上升， 成为全球共同面临的社会问题。目前国内患帕金森氏病总人数已达172万人，55岁以上人 群帕金森氏病患病率近；而患阿尔茨海默病的人数2000年美国就达到了 450万人，如 果治疗方法没有取得有效的进展，预测美国在2050年时，有症状的病例数将达到1320万 人。这类疾病的发病机理与病因错综复杂，其病理机制至今仍然不十分清楚，临床工作中尚 缺乏有效的治疗手段。但是在临床中发现帕金斯病患者的脑脊液和纹状体中发现有高水平 的促炎症因子，如白细胞介素1β，在阿兹海默病患者的脑脊液、血清中也发现了高水平的 白细胞介素1 β。在动物实验中将高浓度的白细胞介素1 β注射到大鼠的黑质中，一段时间 后大鼠表现出了帕金斯氏病的相应症状，上述资料提示白细胞介素1 β与神经退行性疾病 的发病有一定的相关性，抑制促炎性细胞因子的中枢活性有望成为治疗神经退行性疾病的 潜在靶点。而近年来发展起来的RNA干扰技术为此提供了十分有用的工具。RNA干扰(RNAi)是指在生物体内可特异性抑制目的基因的表达，这种现象发生 在转录后水平，因此又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。RNAi是一种从低等生物到哺乳动物都有的保守的防御机制。内源性或外源性双 链RNA(dsRNA)在细胞内被核酸内切酶Dicer切割成多个具有特定长度和结构的小片段 RNA(21-23bp)即siRNA，siRNA与体内一些特异性的酶形成RNA诱导的沉默复合物(RNA Interference SilencingComplex, RISC)。RISC复合物通过配对识别并切割目的mRNA，从 而使目的基因沉默，即RNA干扰现象。RNAi通过关闭特异基因的表达，在基因的表达调控、 恶性肿瘤和遗传性疾病的治疗方面显示出极为重要的应用价值。目前获得siRNA主要通过以下两种方法化学合成法和siRNA表达载体。但由于RNA合成成本高，且易被RNase降解，操作复杂，使得该项技术具有一定的局限性。s iRNA 表达载体因成本低，而且作用持续时间长效率高而被广泛采用。重组腺病毒载体具有生物 安全性好，表达持续时间长，宿主范围广，不仅能转染增殖细胞也可转染非增殖细胞，致病 性低等优点成为大家广泛应用的s iRNA表达载体之一。我们利用腺病毒AdEasy系统，构 建能够抑制1L-1β基因表达的s iRNA ，从而探讨1L-1β在神经退行性疾病中的作用，这将 有助于从分子水平阐明1L-1 β在神经系统疾病中的致病机制，并为神经退行性疾病治疗 提供有用的手段。
发明内容
本发明的目的一在于提供一种抑制大鼠IL-I β基因表达的siRNA。本发明的目的二在于提供上述siRNA的表达载体。本发明的上述目的可以通过以下措施实现。设计抑制大鼠1L-1 β基因表达的siRNA片段根据Ambion公司网站中siRNA 辅助设计工具(http //www. ambion. com)在线寻找IL-I β -siRNA的靶序列，随后用 BLAST(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/biast/blast. cgi)对选择的靶序列进行同源性分 析，排除siRNA非特异性地抑制其他基因片段的可能。设计1L-1β -SiRNA表达载体的插入序列结构根据腺病毒AdEasy系统，插入序列 模板的合成原则是酶切位点+siRNA序列+环状结构+终止序列+酶切位点，为了后续重 组穿梭质粒的检测方便，在设计并合成插入序列模板两端的酶切位点时仅保留四个碱基， 将插入序列连接到穿梭质粒上时，此酶切位点因为缺失一个碱基故被破坏掉。加入转录终 止序列(TTTTTT，polyT)是确保转录准确终止，并在合成DNA的末端设计一个新的Stu I酶 切位点。腺病毒载体的产生根据1998年He等建立的AdEasy系统，穿梭质粒 pAdTrack-CMV含有巨噬细胞病毒启动子(CMV)和绿色荧光蛋白(GFP)，CMV属于RNA聚合 酶II型启动子，最近有研究表明RNA聚合酶II也可以高水平表达siRNA，而且CMV较其他 RNA聚合酶11启动子(如SV40、RSV等)启动性更强，质粒转入细胞，在启动子操纵下转录 生成siRNA。而携带的绿色荧光蛋白基因可以帮助我们通过荧光来检测腺病毒的定位和扩 散情况。在合成siRNA序列之后，重组连接于穿梭质粒上，再将线性化的重组穿梭质粒与骨 架质粒在细菌内同源重组，所得重组腺病毒质粒可以通过卡那霉素筛选出，随后，PacI酶切 后的重组腺病毒质粒转染293细胞包装产生重组腺病毒，进一步用于IL-I β基因功能的研 究和相关神经退行性疾病的治疗。
图1为siRNA发夹结构示意图；图2腺病毒载体构建示意图；图3寡核苷酸片段退火凝胶电泳图；图4重组穿梭质粒酶切鉴定图；图5重组穿梭质粒的测序图谱；图6重组腺病毒质粒的酶切鉴定图7腺病毒转染HEK293细胞24h后GFP表达；
具体实施例方式下面结合具体实施例来描述本发明，应该指出的是，这些实施例仅用于说明本发 明不应理解为对本发明的限制。实施例1大鼠IL-I β基因SiRNA的设计、合成和退火根据siRNA辅助设计工具(http://WWW. ambion. com)在线设计有效靶向IL-I β 基因的三条siRNA，一条对照组的siRNA。siRNA的选择原则如下①以AA开头的19—21nt长的序列；②靶定序列从起始密码子下游75-100个nt处开始，到终止密码子上游 75—IOOnt处结束；③选择的序列中GC含量最好在50%左右；序列中避免出现3个以上G ；④选择的DNA片段经BLAST查询，应与其它人类基因无同源性；克隆入表达载体中的插入序列结构顺序依次为5'端HindIII的酶切位点，正义 序列，Loop环状结构，反义序列，转录终止子，3'端得Sal I酶切位点(图1)。序列由上海 英俊生物公司合成，如下表。
权利要求
1.一种重组腺病毒载体，其特征在于能够表达抑制大鼠IL-I β基因表达的s iRNA。
2.一种可以产生抑制大鼠IL-Ιβ基因表达的siRNA的载体，其特征在于具有以下的基 本结构由启动子、IL-I β编码区、终止密码、DNA序列顺序连接而成的环状双链DNA分子；启动子为可启动产生s iRNA的序列，它是启动它的下游紧邻基因的表达的元件；IL-I β编码区为表达权利要求1所述的siRNA的编码区，由19个核苷酸组成，可采用 碱基互补的原则在细胞内形成双链RNA ；终止密码为6个连续的T ；DNA序列为介于RNA编码区间的DNA序列，含有质粒载体DNA的复制起始位点和抗生素 抗性基因。
3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于所述待插入的siRNA基因具有 与siRNA表达载体的两个粘性末端分别互补的粘性末端。
4.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征还在于腺病毒载体为El区缺失的 复制缺陷型病毒。
5.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征还在于包装细胞为HEK293。
6.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于设计并合成 针对大鼠IL-Ιβ的特异的干扰siRNA，退火形成双链的寡核苷酸片段插入穿梭质粒 pAdTrack-CMV中获得了 pAdTrack-CMV_shRNA重组穿梭质粒，并进行测序分析；PmeI酶线 性化重组质粒pAdTrack-CMV-siIL-Ιβ后转化带有病毒骨架质粒pAdeasy-Ι的感受态细 胞BJ5183，获得病毒质粒pAd-siIL-Ι β，线性化后转HEK293细胞进行包装获得重组腺病毒 Ad-siIL-Ι β 颗粒。
全文摘要
本发明涉及一种siRNA，公开了一种抑制大鼠IL-1β基因表达的siRNA表达载体。本发明设计、合成了靶向大鼠IL-1β基因的三对s iRNA序列，并成功构建了表达s iRNA的重组腺病毒载体。该载体能够持续有效、特异性地沉默IL-1β基因的表达，可用于研究IL-1β的功能以及神经退行性疾病的治疗。
文档编号C12N15/113GK101993894SQ201010240659
公开日2011年3月30日 申请日期2010年7月30日 优先权日2010年7月30日
发明者徐从伦, 游自立 申请人:电子科技大学