专利名称：稳定的几丁质酶及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术酶制剂制备加工领域，特别涉及一种稳定的几丁质酶及其制 备方法。
背景技术：
近年来的研究结果表明，几丁质酶在作物抗真菌病害、人类治疗真菌病、几丁质深 加工等领域有着良好的应用前景。然而，几丁质酶在分离、纯化及在保存过程中极易受PH、 温度、重金属离子、氧等因素的影响，导致活性降低，从而缩短使用寿命。如何减少酶活损 失，延长酶的作用时间成为几丁质酶应用研究必须解决的首要问题，这一问题成为制约几 丁质酶在果蔬采后病害防治领域的深入研究和应用的瓶颈。磁性载体的酶固定化已成为酶工程研究的重点和热点之一。磁性高分子微球表面 可具有各种功能性的基团，用于共价结合目标蛋白酶，改善其稳定性，扩大其使用范围等。 此外，利用磁场，可以方便地分离回收磁性高分子微球修饰过的生物活性物质，可供多次使 用。目前，关于几丁质酶的磁性功能载体固定化的研究尚未见报道。本研究将重组的几丁质 酶固定在功能化的磁性载体上，不但能够加快酶的分离、纯化过程，还可提高酶的稳定性， 这能够在一定程度上减少酶活损失，延长酶的使用时间，为重组几丁质酶的产业化应用奠 定基石出。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定的几丁质酶及其制备方法，即功能 化磁性载体固定几丁质酶的制备方法。是一种用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内， 仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的技术。本发明的技术方案是一种稳定的几丁质酶，其特征在于所述的几丁质酶是被固定在带有功能性基团 的固定化磁性载体上。所述的磁性载体是指铁氧体磁性载体。所述的铁氧体磁性载体是指Fe304磁性微粒载体。所述的Fe304磁性微粒是指粒径小于80nm的微粒。所述的功能性基团是指醛基、环氧基、氯甲基、甲苯磺酰基、羟基、氨基、羧基、巯基 中的任意一种或几种。上述稳定的几丁质酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)制备磁性载体微粒采用高分子包埋法、单体聚合法、原位法或共沉淀法制备 磁性载体微粒；(2)磁性微粒的功能化采用带有功能基团的单体对磁性载体微粒进行功能化；(3)磁性载体功能基团的预活化对功能化的磁性载体微粒的功能基团进行预先 活化；
(4)几丁质酶的固定化以几丁质酶的不同结合区作为结合位点，将几丁质酶固 定在预先活化了的功能化磁性载体微粒上。稳定的几丁质酶的制备方法，其特征在于(1)制备Fe304磁性载体微粒采用高分子包埋法、单体聚合法、原位法或共沉淀法 制备Fe304磁性载体微粒；(2)Fe304磁性微粒的功能化采用带有功能基团的单体对磁性载体微粒进行功能 化，所述的功能性基团单体为醛基、环氧基、氯甲基、甲苯磺酰基、羟基、氨基、羧基、巯基中 的任意一种或几种；(3)Fe304磁性载体功能基团的预活化对功能化的磁性载体微粒的功能基团进行 预先活化，其中功能基团的预先活化的方法为溴化氰法、戊二醛法、碳二亚胺法中的任意一 种或几种；(4)几丁质酶的固定化以几丁质酶的不同结合区作为结合位点，将几丁质酶固 定在预先活化了的功能化Fe304磁性载体微粒上，其中所述的几丁质酶的不同结合区是指 不同氨基酸残基上的巯基、C-端羧基或N-端氨基。本发明效果是磁性高分子微球表面具有的各种功能性的基团，用于共价结合目标蛋白酶，改善 其稳定性，扩大其使用范围等。此外，利用磁场，可以方便地分离回收磁性高分子微球修饰 过的生物活性物质，可供多次使用。将重组的几丁质酶固定在功能化的磁性载体上，能够加 快酶的分离、纯化过程，还可提高酶的稳定性，能够在一定程度上减少酶活损失，延长酶的 使用时间，为重组几丁质酶的产业化应用奠定了基础。功能化磁性载体固定几丁质酶技术，将为几丁质酶产业化开辟一条更为切实可行 的新途径，必将促进几丁质及几丁质酶工产业技术革新和发展。
图1是4°C条件下固定化重组几丁质酶的贮藏稳定性图表图2是固定化重组几丁质酶重复利用性图表
具体实施例方式本发明采用功能化磁性载体对几丁质酶进行固定化，具体方法为采用化学共沉 淀法制备Fe304磁性微粒。然后采用带有功能基团的单体对磁性微粒进行功能化，制备出酶 固定化载体。以重组几丁质酶的结合区(CBD)中不同氨基酸残基上的巯基、C端的羧基或N 端的氨基作为结合位点，对重组几丁质酶进行固定化。功能化磁性载体固定几丁质酶技术， 将为几丁质酶产业化开辟一条更为切实可行的新途径，必将促进几丁质及几丁质酶工产业 技术革新和发展。功能化磁性载体以铁氧体为核。铁氧体主要指四氧化三铁(Fe403)。铁氧体为纳 米级铁氧体，粒径小于80nm。磁性微粒功能化制备方法包括高分子包埋法、单体聚合法、原位法、共沉淀法等。其中引入的基团包括醛基、环氧基、氯甲基、甲苯磺酰、羟基、氨基、羧基、巯基等。功能基团预先活化的方法包括溴化氰法、戊二醛法、碳二亚胺法等。
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实例1 以Fe3O4的磁性微球为磁核，采用环氧基化和氨基化修饰的两种磁性高分子微球(A-type和P-type)，作为酶固定化载体，对重组几丁质酶进行固定化研究。结果表 明P-type单位蛋白载量、纯化倍数均高于A-type，分别为1689. 7436mg/g、6. 8013 ；4°C环 境中贮藏10d，P-type固定的重组几丁质酶剩余酶活力为69. 66% ；重复利用7次后，剩余 酶活力在44%以上。
权利要求
一种稳定的几丁质酶，其特征在于所述的几丁质酶是被固定在带有功能性基团的固定化磁性载体上。
2.根据权利要求1所述的稳定的几丁质酶，其特征在于所述的磁性载体是指铁氧体 磁性载体。
3.根据权利要求1所述的稳定的几丁质酶，其特征在于所述的铁氧体磁性载体是指 Fe3O4磁性微粒载体。
4.根据权利要求2所述的稳定的几丁质酶，其特征在于所述的Fe3O4磁性微粒是指粒 径小于80nm的微粒。
5.根据权利要求1所述的稳定的几丁质酶，其特征在于所述的功能性基团是指醛基、 环氧基、氯甲基、甲苯磺酰基、羟基、氨基、羧基、巯基中的任意一种或几种。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的稳定的几丁质酶的制备方法，其特征在于包括 如下步骤(1)制备磁性载体微粒采用高分子包埋法、单体聚合法、原位法或共沉淀法制备磁性 载体微粒；(2)磁性微粒的功能化采用带有功能基团的单体对磁性载体微粒进行功能化；(3)磁性载体功能基团的预活化对功能化的磁性载体微粒的功能基团进行预先活化；(4)几丁质酶的固定化以几丁质酶的不同结合区作为结合位点，将几丁质酶固定在 预先活化了的功能化磁性载体微粒上。
7.根据权利要求6所述的稳定的几丁质酶的制备方法，其特征在于(1)制备Fe3O4磁性载体微粒采用高分子包埋法、单体聚合法、原位法或共沉淀法制备 Fe3O4磁性载体微粒；(2)Fe3O4磁性微粒的功能化采用带有功能基团的单体对磁性载体微粒进行功能化， 所述的功能性基团单体为醛基、环氧基、氯甲基、甲苯磺酰基、羟基、氨基、羧基、巯基中的任 意一种或几种；(3)Fe3O4磁性载体功能基团的预活化对功能化的磁性载体微粒的功能基团进行预先 活化，其中功能基团的预先活化的方法为溴化氰法、戊二醛法、碳二亚胺法中的任意一种或 几种；(4)几丁质酶的固定化以几丁质酶的不同结合区作为结合位点，将几丁质酶固定在 预先活化了的功能化Fe3O4磁性载体微粒上，其中所述的几丁质酶的不同结合区是指不同氨基酸残基上的巯基、C-端羧基或N-端氨基。
全文摘要
一种稳定的几丁质酶及功能化磁性载体固定几丁质酶的制备方法，采用功能化磁性载体对几丁质酶进行固定化，功能化磁性载体以铁氧体为核；制备Fe3O4磁性微粒；然后采用带有功能基团的单体对磁性微粒进行功能化，制备出酶固定化载体；以重组几丁质酶的结合区不同基团作为结合位点，先进行功能基团预先活化，再对重组几丁质酶进行固定化。磁性高分子微球表面的各种功能性基团，可共价结合目标蛋白酶，改善稳定性，扩大使用范围。利用磁场可以方便地分离回收磁性高分子微球修饰过的生物活性物质，可供多次使用。将重组的几丁质酶固定在功能化的磁性载体上，能够加快酶的分离、纯化过程，提高酶的稳定性，减少酶活损失，延长酶的使用时间。
文档编号C12N11/14GK101805729SQ20101012693
公开日2010年8月18日 申请日期2010年3月18日 优先权日2010年3月18日
发明者关文强, 封丽, 李昆仑, 贾凝, 阎瑞香 申请人:国家农产品保鲜工程技术研究中心(天津)