一种高粱花药高效诱导培养基配方的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高粱花药高效诱导培养基配方，具体涉及一种显著提高高粱花药 出愈率的诱导培养基配方，属于农业科学技术领域。
【背景技术】
[0002] 高梁为禾本科高粱属一年生草本植物，是我国最早种植的禾谷类作物之一。高粱 在世界谷物生产中占有重要地位，6大洲47个国家每年种植面积约0. 45亿hm，为世界第五 大作物。高梁具有食用、饲用、酿造用、能源用及加工用等多种用途，在我国，高梁主要用于 酿酒，但随着畜牧业、能源业、加工业及膳食结构的改变，饲料、饲草高梁、能源甜高梁、帚用 高粱及食用高梁等具有特殊用途的高粱越来越受到重视，种植面积不断扩大。
[0003] 高粱抗逆性强、适应性广且综合利用价值高而在国民经济中占有不可替代的重要 地位。高粱具有耐旱、耐涝、耐贫瘠、耐盐碱等多重抗性，生物量大，是公认的抗旱性较强的 作物，在水资源严重短缺的干旱和半干旱地区具有很大的发展潜力。高粱以其独具的高含 糖量、高生物产量、高乙醇转化率和高抗逆性被誉为"高能作物"，成为符合我国国情、适合 我国国土和气候条件、既产能源又产粮食的理想作物之一。加强高粱茎杆生物能源综合开 发利用，对缓解国家能源紧张、改善生态环境、促进国民经济稳定持续发展，都具有十分重 要而深远的意义。
[0004] 我国的高梁产区集中在东北、华北和西北地区，品种资源丰富，这为新品种的选育 奠定了丰厚的遗传基础。高产、含糖量高、抗性好、适应性广的高粱品种是促进高粱生产发 展的核心和基础。随着生物技术的发展和市场需求的变化，高粱的育种方法也有了很大发 展。目前我国高粱的育种方法主要有：传统育种方法、诱变育种法、倍性育种法、分子育种法 等。针对高粱产业化开发的实践需求，创新育种思路，加快品种选育，为生产提供适宜的新 品种，将有力地推动高粱产业的发展，并且可以促进种植业结构调整和农村经济发展。
[0005] 花药培养是利用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药。通过无菌操作接 种在培养基上，在一系列条件诱导下改变花药的发育程序，进行有丝分裂，经过脱分化后形 成细胞团，进而形成愈伤组织，经历再分化发育成完整的单倍体植株的过程。现在花药培养 集成了杂交育种、诱变育种、细胞学、遗传学等各种生物科学的内容，是育种学发展的趋势 之一，利用花药培养可以明显的加快育种进程、缩短育种年限。
[0006] 目前小麦、水稻、玉米及木本植物的花药培养已经取得了成功，而高梁的花药培养 诱导单倍体的方法和培养基还不完善。培养基是花药培养的物质基础，直接关系到培养物 的生长与分化，培养基组分是影响花培成功的一个很重要的因素，多种禾本科作物花培实 验表明：培养基各组分的合适用量，以及它们之间一定的组合关系，可显著影响花培效率， 发现和优化组合花药培养有机附加物质，可进一步提高花药培养力。
[0007] 在花药程序中，愈伤组织的诱导培养是水稻花药培养过程的第一步，也是重点和 难点，而花药愈伤组织诱导的频率和质量直接决定着花药培养的成败。因此，组合和优化培 养基组分，摸索出实用的花药诱导培养基配方是实现高粱花药诱导培养的关键。通过多年 高粱花药培养的摸索和实践，我们进一步优化了基本培养基配方，并且不断尝试加入一些 提高高粱药诱导力的有机添加物并组合其种类搭配及浓度，最终摸索出了一种高粱花药高 效诱导培养基配方。我们的研究结果对于进一步推广和应用高粱单倍体育种和理论研究无 疑有较大的现实意义和实用价值。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种高粱花药高效诱导培养培养基，该培养基的配方如下： KNO3 1500 ~1800mg/L，NH4NO3 900 ~1100mg/L，KH2PO4 230 ~270mg/L，CaCl2* 2H20 270 ~330mg/L，MgSO4 120 ~140mg/L，Na2-EDTA 35 ~40mg/L，FeS04· 7H20 26 ~30mg/ L，MnSO4* H 20 10 ~12mg/L，ZnS04· 7H 20 5· 5 ~6. 5mg/L，H3BO3 3· 5 ~4. 5mg/L，KI 0· 9 ~ I. lmg/L，CuS04· 5H20 0· 035 ~0· 045mg/L，CoCl · 6H20 0· 035 ~0· 045mg/L，NaMoO4* 2H20 0.09~0.11mg/L，甲基横酸乙醋0.5~0.7mg/L，甘氛酸1.8~2.2mg/L，肌醇45~55mg/ L，维生素 BI 0· 45 ~0· 55mg/L，维生素 B6 0· 45 ~0· 55mg/L，烟酸 0· 45 ~0· 55mg/L，D-阿 拉伯糖基-2-去氧已糖0· 2~0· 3g/L，鹿糖32~38g/L，植物凝胶4. 5~5. 5g/L ; 2.4- D 2. 3~2. 7mg/L，激动素 L 4~I. 6mg/L，复酞核酸0· 7~0· 9mg/L，植物硫化激动 素 PSK-α 35 ~45pmol/L，胰岛素 4. 5 ~5. 5mg/L，水解蛋白 0· 25 ~0· 35g/L，PH 5. 8 ~ 6. 0〇
[0009] 本发明所述的培养基具有显著提高高粱花药出愈率的优点，可以大幅度地提高高 粱花药培养效率。下面的实施例以及对比实验可以清楚地反映本发明所述培养基的特点。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1 配制如下配方的培养基： KNO3 1650mg/L, NH4NO3 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, CaCl2* 2H 20 300mg/L, MgSO4 130mg/ L, Na2-EDTA 37. 5mg/L, FeSO4* 7H 20 28mg/L, MnSO4* H 20 llmg/L, ZnSO4* 7H 20 6. Omg/L, H3BO3 4. Omg/L, KI 1.0 mg/L, CuSO4* 5H20 0. 04mg/L, CoCl · 6H20 0. 04mg/L, NaMoO4* 2H 20 O.lmg/L,甲基磺酸乙酯0.6mg/L,甘氨酸2.0mg/L,肌醇50mg/L,维生素 BI 0.5mg/L,维生 素 B6 0.5mg/L,烟酸0.5mg/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.25g/L,鹿糖35g/L,植物凝 胶 5. 0g/L ; 2.4- D 2. 5mg/L，激动素 I. 5mg/L，复酞核酸0· 8mg/L，植物硫化激动素 PSK- a 40pmol/ L，胰岛素 5.0mg/L，水解蛋白 0.3g/L，PH 5.9。 toon] 选取高粱品种关东青和平原红作为花药培养供体，采集主茎上的圆锥花序，其花 药中的小孢子处于单核晚期，表面消毒后，5°C下低温预处理2天。用60%的乙醇表面消毒 3分钟，然后进一步外植体消毒后接种花药于该诱导培养基，每个培养皿接种30枚花药，在 温度为28°C、湿度70%左右的环境下暗培养。愈伤组织形成后（长到2 mm左右)，计算愈伤 组织诱导率，然后转移入再生培养基。
[0012] 实施例2 配制如下配方的培养基（甲基磺酸乙酯添加浓度的优选）： KNO3 1650mg/L, NH4NO3 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, CaCl2* 2H 20 300mg/L, MgSO4 130mg/ L，Na2-EDTA 37. 5mg/L，FeSO4* 7H20 28mg/L，MnSO4* H2O I lmg/L，ZnS04*7H 20 6.0mg/L，H3BO3 4. Omg/L, KI 1.0 mg/L, CuSO4* 5H20 0. 04mg/L, CoCl · 6H20 0. 04mg/L, NaMoO4* 2H 20 0. lmg/ L，甘氨酸 2.0mg/L，肌醇 50mg/L，维生素 BI (X5mg/L，维生素 B6 (X5mg/L，烟酸（X5mg/L， D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.25g/L，蔗糖35g/L，植物凝胶5.0g/L; 2.4- D 2. 5mg/L，激动素 I. 5mg/L，复酞核酸0· 8mg/L，植物硫化激动素 PSK- a 40pmol/ L，胰岛素 5.0mg/L，水解蛋白 0.3g/L，PH 5.9。
[0013] 甲基磺酸乙酯的添加浓度设置以下8种：0 ;0· I mg/L ;0· 2 mg/L ;0· 3 mg/L ; 0. 4mg/L ；0. 6mg/L ；0. 7mg/L ；0. 8mg/L〇
[0014] 同样选取该两个高粱品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈 伤组织诱导率。
[0015] 实施例3 配制如下配方的培养基(凝固剂的优选）： KNO3 1650mg/L, NH4NO3 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, CaCl2* 2H 20 300mg/L, MgSO4 130mg/ LjNa2-EDTA 37. 5mg/L, FeSO4* 7H 20 28mg/L,MnS04· H 20 llmg/L,ZnS04· 7H20 6. Omg/L, H3BO3 4. Omg/L, KI 1.0 mg/L, CuSO4* 5H20 0. 04mg/L, CoCl · 6H20 0. 04mg/L, NaMoO4* 2H 20 0. lmg/ L，甲基磺酸乙酯0· 6mg/L,甘氨酸2. Omg/L,肌醇50mg/L,维生素 BI 0· 5mg/L,维生素 B6 0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.25g/L，鹿糖35g/L; 2.4- D 2. 5mg/L，激动素 I. 5mg/L，复酞核酸0· 8mg/L，植物硫化激动素 PSK- a 40pmol/ L，胰岛素 5.0mg/L，水解蛋白 0.3g/L，PH 5.9。
[0016] 凝固剂设置为以下2种：植物凝胶2. 5g/L，琼脂3. 5g ;琼脂7g。
[0017] 同样选取该两个高粱品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈 伤组织诱导率。
[0018] 实施例4 配制如下配方的培养基(肌醇添加浓度的优选）： KNO3 1650mg/L, NH4NO3 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, CaCl2* 2H 20 300mg/L, MgSO4 130mg/ LjNa2-EDTA 37. 5mg/L, FeSO4* 7H 20 28mg/L,MnS04· H 20 llmg/L,ZnS04· 7H20 6. Omg/L, H3BO3 4. Omg/L, KI 1.0 mg/L, CuSO4* 5H20 0. 04mg/L, CoCl · 6H20 0. 04mg/L, NaMoO4* 2H 20 0. lmg/ 1^，甲基磺酸乙酯0.611^/1，甘氨酸2.〇11^/1，维生素1310.511^/1，维生素136 0.511^/1，烟酸 0.5mg/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.25g/L，蔗糖35g/L，植物凝胶5.0g/L; 2.4- D 2. 5mg/L，激动素 I. 5mg/L，复酞核酸0· 8mg/L，植物硫化激动素 PSK- a 40pmol/ L，胰岛素 5.0mg/L，水解蛋白 0.3g/L，PH 5.9。
[0019] 肌醇的添加浓度设置以下 8 种：0 ;10mg/L ;20mg/L ;30mg/L ;40mg/L ;60mg/L ; 70mg/L ;80mg/L。
[0020] 同样选取该两个高粱品种作为花药供体，操作方法、培养方法同实施例1，计算愈 伤组织诱导率。
[0021] 实施例5 配制如下配方的培养基（D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖添加浓度的优选）： KNO3 1650mg/L, NH4NO3 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, CaCl2* 2H 20 300mg/L, MgSO4 130mg/ LjNa2-EDTA 37. 5mg/L, FeSO4* 7H 20 28mg/L,MnS04· H 20 llmg/L,ZnS