[0063] (l)T-A克隆：将ambiguity的序列提取出来，找到区分ambiguity的位点，如果是 在2和3号外显子区，将片段1与PMDlST-vector连接、转化、涂板、挑单克隆测序；如果在 4号外显子区，将片段2与PMDlST-vector连接、转化、涂板、挑单克隆测序。对于单个个体 来说，染色体是成对出现的，sanger测序产生的峰图也只是反映了两条染色体的序列组合 情况，经过挑单克隆测序，我们可W获取单条染色体的序列信息，从而找到区分ambiguity 的位点，获得更精确的分型。
[0064] (2)设计allele特异性的引物：对于2、3、4号外显子序列完全一样的ambiguity 分型，我们需要将ambiguity序列提取出来，在其他外显子区查找区分ambiguity的位点， 确定位点位置后，针对该位点设计特异性的引物，进行PCR和DNA电泳，分析特异性引物是 否可朗Γ增出目的条带。举个简单的例子，如果ambiguity分型结果为分型1或者分型2， 那么有目的条带为分型1，没有目的条带则为分型2。
[0065] 本发明所述T-A克隆的详细步骤：
[0066] 一、扩增可W区分ambiguity的片段（3号外显子为例）
[0067] 选用LAtaq货号：TaKaRaDRR002A(可W加polyA尾，便于后续的与T载体连接）
[006引反应体系：
[0069]
[0070] 反应条件：
[0071]
[0072]
[0073] 二、纯化PCR产物：
[0074]切胶回收试剂盒：0MEGA Gel Extraction KitD2500-02 [00巧]步骤如下：
[0076] 1、1%agarosegelDM电泳后，在紫外灯下将目的条带切下，称重放入EP管中备 用（小于200mg最佳）。
[0077] 2、加入1倍体积（Img对应1μL)的XP2,60度水浴7min，每2-3min震荡混匀。
[007引 3、将2中液体转移至分离柱中，13000g离屯、Imin，弃液。
[0079] 4、向柱中加入300μL的XP2,13000g离屯、Imin，弃液。
[0080] 5、向柱中加入 700μLSPWwastibuffer, 13000g离屯、Imin，弃液。
[0081] 6、13000g空离2min，将柱子放在1. 5ml的EP管上。
[0082] 7、向柱中加入 15-30μL的elutionbuffer,静置 2min，13000g离屯、Imin。
[0083] 8、Nano化op检测DNA浓度和质量，OD值 1. 8-2. 0。
[0084]Ξ、与Τ载体连接
[0085] Τ载体为PMD-18-T vector,货号：TaKaRa DIOIA
[0086] 连接体系为
[0087]
[0088] 16°C，30min
[0089] 计算公式：ng=nmols*660*插入片段bp数
[0090] 载体50ng约0. 0化mol,插入片段一般为载体的2~10倍。
[0091] 四、转化、涂板
[0092] 1、将大肠杆菌D册α冰上解冻备用，备42°C水浴。
[0093] 2、将加1的连接产物加入到50ul的畑5α中混匀，冰上静置30min。
[0094] 3、将2中的混合物放入42°C水浴锅中热激90s，立即放冰上2min。
[0095] 4、向3中的混合物中加ImL的LB，37°C摇床摇比。
[0096] 5、将摇好的菌液4000巧m2min离屯、，留取400ul上清，其他弃掉，吹打混匀后取 200ul涂板。
[0097] 6、放37°C溫箱过夜，约12h。
[0098] 五、一个菌板对应一个样本，将每个做好克隆的菌板挑3个克隆送公司单向测序。 [00 9引实施例2
[0100] 本实施例通过实施例1中所述方法对16例样本进行HLA-B传统分型，分型结果跟 博奥公司的分型结果完全一致。
[0101]W针对24号样本进行HLA-B基因分型为例：
[010引一、样本DNA的制备：提取DNA浓度 45ng/μL约 50μL260/280 = 1. 88
[010引二、扩增HLA-B的2、3、4号外显子：按上述条件PCR后，电泳图如图2所示，该图列 出了 24、25、26、27号四个样本PCR产物的电泳结果，与目的条带大小一致。
[0104] 三送sanger测序。获得含有双峰的峰图，如图3所示。
[0105] 四、应用我们的自写软件对HLA-B进行分型：
[0106] 获得的候选序列有下面几种组合：
[0107]分型 1B巧 8:41 巧*40:49
[010引 分型 2B巧8:61 巧*40:87:02
[0109]分型 3B巧8:01:01 ;B*40:01
[0110] 五、进行T-A克隆：将ambiguity的序列提取出来，找到区分ambiguity的位点，该 位点存在于2和3号外显子区，因此扩增2号和3号外显子与PMDlST-vector连接、转化、 涂板、挑单克隆测序。
[0111] 六、确定分型：根据T-A克隆的结果我们确定该样本的正确分型结果是：分型 38巧8:01:01;8*40:01，与公司分型结果一致。
[0112] 最后应当说明的是，W上实施例仅用W说明本发明的技术方案而非对本发明保护 范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理 解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和 范围。
【主权项】
1. 一种用于HLA基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增HLA-B基因 的2号外显子和3号外显子的引物，和用于扩增HLA-B基因的4号外显子的引物； 所述用于扩增HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的引物包括由SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示的引物序列组成的扩增引物对； 所述用于扩增HLA-B基因的4号外显子的引物包括由SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所 示的引物序列组成的扩增引物对。2. -种HLA基因分型的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 提取待测样本的DNA; (2) 分别采用由SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示的引物序列组成的扩增引物对和由 SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4所示的引物序列组成的扩增引物对，对待测样本DNA进行PCR 扩增，得到含有HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的第一扩增片段和含有HLA-B基因 的4号外显子的第二扩增片段，然后分别纯化含有HLA-B基因的2号外显子和3号外显子 的第一扩增片段和含有HLA-B基因的4号外显子的第二扩增片段； (3) 将步骤（2)纯化后的第一扩增片段和第二扩增片段分别进行测序； (4) 将步骤（3)中的测序结果与数据库中HLA基因的外显子标准序列进行对比，确定 HLA基因的型别。3. 根据权利要求2所述的HLA基因分型的方法，其特征在于，所述步骤（4)中数据库为 国际组织頂GT数据库。4. 根据权利要求2所述的HLA基因分型的方法，其特征在于，如果比对后出现模棱两可 的分型结果，则将步骤（2)中的第一扩增片段和第二扩增片段分别进行T-A克隆，然后进行 测序比对，确定HLA基因的型别。5. 根据权利要求2所述的HLA基因分型的方法，其特征在于，如果比对后出现模棱两可 的分型结果，则针对步骤（2)中的第一扩增片段和第二扩增片段分别设计allele特异性的 引物进行区分，然后进行扩增后测序比对，确定HLA基因的型别。
【专利摘要】本发明提供了一种用于HLA基因分型的试剂盒和一种HLA基因分型的方法，所述试剂盒包括用于扩增HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的引物，和用于扩增HLA-B基因的4号外显子的引物；所述用于扩增HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的引物包括由SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.2所示的引物序列组成的扩增引物对；所述用于扩增HLA-B基因的4号外显子的引物包括由SEQ？ID？NO.3和SEQ？ID？NO.4所示的引物序列组成的扩增引物对。采用本发明的分型方法和试剂盒能够使分型流程更加简单，在降低成本的同时增加分型分辨率和准确率，从而进一步应用到科研和临床工作中去。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105255875
【申请号】CN201510757211
【发明人】贝锦新, 冯丽娜, 左晓宇, 刘稳升
【申请人】中山大学肿瘤防治中心
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月6日