一种马来穿山甲线粒体全基因组序列的扩增引物组和扩增方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体设及一种马来穿山甲线粒体全基因组序列的扩 增引物组和扩增方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 马来穿山甲（Manisjavanica)隶属于鱗甲目、穿山甲科、穿山甲属，主要分布于泰 国、马来西亚、细甸、印尼、新加坡等地，生活在低海拔森林及次生林中。马来穿山甲的鱗片 具有很高的药用价值，近年来，过渡猎捕导致马来穿山甲野生资源日益减少，已被IUCN列 为极危动物。为了保护野生资源，恢复马来穿山甲野生种群数量，研究其种群遗传结构和野 生群体遗传变异水平非常必要。
[0003] 分子标记是在DNA水平上对遗传多样性的直接反映，具有数量多，多态性好，遗传 稳定等优势，是研究遗传变异的理想方法。其中，线粒体基因组是一个非常有效的遗传标 记，与核基因组相比，线粒体基因组具有母系遗传、结构简单、进化速率快等独特的遗传特 性；与单个线粒体基因相比，线粒体基因组全序列能够提供更为丰富的信息。
[0004] 因此，线粒体全基因组是进行马来穿山甲群体结构和遗传变异研究的有效工具， 建立一种扩增马来穿山甲线粒体的有效方法对野生资源保护与利用有重要意义。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的是提供一种马来穿山甲线粒体全基因组序列的扩增引物组，利用该 扩增引物组能够特异性的扩增出马来穿山甲线粒体全基因组序列，为马来穿山甲的保护遗 传学、进化遗传学及其物种的分子鉴定提供基础。
[0006] 本发明的马来穿山甲线粒体全基因组序列的扩增引物组，其特征在于，包括下述5 对扩增引物：
[0007]Lsc引物对：
[0008]LscF:5' -AGCGGTCAAATCCAGACTAAC-3'（其核巧酸序列如沈QIDNO. 1 所示）
[0009]LscR:5' -AGAATGGGGTCACCTCCTCC-3'；（其核巧酸序列如沈QIDNO. 2 所示）
[0010]Lee引物对：
[0011]LeeF:5' -CGTCAATCCTTGGGGCTATC-3'（其核巧酸序列如沈QIDNO. 3 所示）
[0012] LeeR:5, -GCCTGGGTTATGTGGTTTCG-3' ；（其核巧酸序列如沈QIDNO. 4 所示）
[001引Len引物对：
[0014]LenF:5, -GGCATAATCCTGTTCATTGTCT-3'（其核巧酸序列如沈QIDNO. 5 所示）
[0015]LenR:5, -AACGGGTGTCTGTCATCCTCT-3'；（其核巧酸序列如沈QIDNO. 6 所示）
[001引Lnc引物对：
[0017]LncF:5' -ACACAAACTATGAGCGAACCC-3'（其核巧酸序列如沈QIDNO. 7 所示） [001 引LncR:5' -AGGATGAAGTGAAGAGCGAAG-3' ；（其核巧酸序列如沈QIDNO. 8 所示）
[001引Lcs引物对：
[0020]LcsF:5' -GGATTCTCGGTAGACAAAGC-3'（其核巧酸序列如沈QIDNO. 9 所示） [00引]LcsR:5' -TCAATTAACGGATTATCTGGAC-3'（其核巧酸序列如沈QIDNO. 10 所示）。
[0022] 本发明的第二个目的是提供一种扩增马来穿山甲线粒体全基因组序列的方法，其 特征在于，W马来穿山甲全基因组DNA作为模板，W上述5对扩增引物分别作为引物化进 行PCR扩增，然后将扩增得到的PCR产物测序后，拼接得到马来穿山甲线粒体全基因组序列 (其核巧酸序列如SEQIDNO. 11所示）。
[0023] 本发明的第Ξ个目的是提供上述马来穿山甲线粒体全基因组序列的扩增引物组 在扩增得到马来穿山甲线粒体全基因组序列中的应用。
[0024] 本发明建立扩增马来穿山甲线粒体基因组的有效方法，利用该扩增引物组能够特 异性的扩增出马来穿山甲线粒体全基因组序列，为马来穿山甲的保护遗传学、进化遗传学 及其物种的分子鉴定提供基础。
【具体实施方式】：
[00巧]W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0026] 实施例1:
[0027] 本发明的马来穿山甲线粒体全基因组序列的扩增引物为5对，引物序列及扩增范 围如表1所示：
[002引表1 :马来穿山甲线粒体基因组扩增片段及引物
[0029]
[0030] (1)马来穿山甲基因组DNA的提取
[0031] 剪取马来穿山甲肌肉组织于2血离屯、管中，将组织剪碎，加800μL消化缓冲液， 10μL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀后于55°C消化过夜。消化清透后，加入800μL饱和酪，轻 轻颠倒混匀20min，lOOOOg离屯、lOmin，抽提上清。加入400μL饱和酪，400μL氯仿/异戊 醇（24:1)，轻轻颠倒混匀20min，lOOOOg离屯、lOmin，抽提上清。加入800μL氯仿/异戊 醇（24:1)，轻轻颠倒混匀20min，10000g离屯、lOmin，抽提上清。加入ImL预冷的无水乙醇， 于-20°C冷冻化，12000g离屯、15min，弃上清。加预冷的70%乙醇，小屯、洗涂DNA沉淀两次， 12000g离屯、5min，弃上清。惊干乙醇，加入50μL超纯水溶解沉淀，置于-20°C保存备用。 获得马来穿山甲基因组DNA
[003引似PCR扩增5个长片段
[0033] 线粒体基因组DNA片段用长PCR技术扩增，长片段PCR扩增体系为25μL包括约 lOng步骤（1)获得的马来穿山甲基因组DNA，2. 5μΙ10XLAPCRbufferΙΙ，0. 4mMdNTP， 上下游引物（表1中的5对引物分别进行扩增，即用Lsc引物对、Lee引物对、Lcn引物 对、Lnc引物对和Lcs引物对分别进行扩增）各0. 4μM，1. 25ULATaq聚合酶灯akara)。 PCR扩增条件为：首先94°C预变性4min，然后进行30个循环，每个循环包括94°C变性 30sec，55°C退火30sec，72°C延伸2-4min，最后72°C延伸lOmin。PCR产物纯化后直接进 行双向测序，然后设计中间测序引物，通过引物步移的方法逐步测通整个片段。测序结果 用sequencher4. 2(GeneCodes,AnnArbor,MI,USA)软件拼接，先将每个长片段拼接完整， 再将五个长片段拼接起来，获得完整的马来穿山甲线粒体基因组全序列（其核巧酸序列如 SEQIDNO. 11所示），其结构如表2所示。
[0034]Lsc引物对扩增马来穿山甲线粒体全基因组序列的第2280-6014bp，Lee引物对 扩增马来穿山甲线粒体全基因组序列的第5792-909化P、Lcn引物对扩增马来穿山甲线粒 体全基因组序列的第8850-11696bp、Lnc引物对扩增马来穿山甲线粒体全基因组序列的第 11155-14695bp和Lcs引物对扩增马来穿山甲线粒体全基因组序列的第14640-2324bp。
[0035] 表2马来穿山甲线粒体基因组结构
[0036]
[0037]
【主权项】
1. 一种马来穿山甲线粒体全基因组序列的扩增引物组，其特征在于，包括下述5对扩 增引物： Lsc引物对： LscF:5' -AGCGGTCAAATCCAGACTAAC-3' LscR:5' -AGAATGGGGTCACCTCCTCC-3' ； Lee引物对： LeeF:5' -CGTCAATCCTTGGGGCTATC-3' LeeR:5' -GCCTGGGTTATGTGGTTTCG-3' ； Len引物对： LenF:5' -GGCATAATCCTGTTCATTGTCT-3' LenR:5' -AACGGGTGTCTGTCATCCTCT-3' ； Lnc引物对： LncF:5' -ACACAAACTATGAGCGAACCC-3' LncR:5' -AGGATGAAGTGAAGAGCGAAG-3' ； Lcs引物对： LcsF：5, -GGATTCTCGGTAGACAAAGC-3, LcsR:5' -TCAATTAACGGATTATCTGGAC-3'。2. -种扩增马来穿山甲线粒体全基因组序列的方法，其特征在于，以马来穿山甲全基 因组DNA作为模板，以权利要求1所述的5对扩增引物分别作为引物对，进行PCR扩增，然 后将扩增得到的PCR产物测序后，拼接得到马来穿山甲线粒体全基因组序列。3. 权利要求1所述的马来穿山甲线粒体全基因组序列的扩增引物组在扩增得到马来 穿山甲线粒体全基因组序列中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种马来穿山甲线粒体全基因组序列的扩增引物组和扩增方法及其应用。扩增引物组包括下述5对扩增引物：Lsc引物对：Lsc？F：5’-AGCGGTCAAATCCAGACTAA？C-3’，Lsc？R：5’-AGAATGGGGTCACCTCCTCC-3’；Lcc引物对：Lcc？F：5’-CGTCAATCCTTGGGGCTATC-3’，Lcc？R：5’-GCCTGGGTTATGTGGTTTCG-3’；Lcn引物对：Lcn？F：5’-G？GCATAATCCTGTTCATTGTCT-3’,Lcn？R：5’-AACGGGTGTCTGTCATCCTCT-3’；Lnc引物对：LncF：5’-ACACAAACTATGAGCGAACCC-3’,Lnc？R：5’-AGGATGAAGTGAAGAGCGAAG-3’；Lcs引物对：Lcs？F：5’-GGATTCTCGGTAGACAAAGC-3’,Lcs？R：5’-TCAATTAACGGATTATCTGGAC-3’。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/10
【公开号】CN105255872
【申请号】CN201510752411
【发明人】龚世平, 李伟业, 滑溜帅, 葛研, 王付民, 侯方晖
【申请人】广东省昆虫研究所
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月4日