专利名称：植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T构建及启动子活性鉴定的制作方法
植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T构建及启动子活性鉴
定
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，主要涉及植物线粒体通用表达载体PSK-E-P/ T的构建策略和实施，包括载体构建中关键性元件之一的来自“津研四号”品种黄瓜线粒体 质粒PC3序列、基因cob启动子序列和基因atp9终止子序列，以及启动子活性鉴定与相关 方法。
背景技术：
线粒体是植物的重要细胞器，与植物的能量代谢、光呼吸作用、雄性不育和细胞凋 亡等重要生命现象相关。雄性不育(CMS)在开花植物中广泛存在，CMS品系的培育是高等植 物传统杂交育种的关键环节，在农业生产中占有举足轻重的作用。最近的研究显示CMS与 mtDNA和核基因组相互有关，mtDNA的重排或基因变异可导致CMS发生，某些核基因产物如 MshURFlA和RFlB等通过影响mtDNA结构或阻止mtDNA中CMS相关基因的表达恢复育性。 因此，在应用上，可以利用本发明的线粒体表达载体载体，将与CMS相关基因导入植物线粒 体中，改变原有植物的线粒体遗传特性，在分子水平培育细胞质雄性不育等杂交育种所需 要的植物重要品系，从根本上改变目前不育系建立中使用的繁琐回交育种程序。另外，还可 以利用线粒体作为生物反应器(bioreactor)，大量生产外源蛋白质。在国际上，植物线粒体基因工程研究起步不久，我国尚处空白阶段。
发明内容本发明的目的是解决植物线粒体遗传转化中的分子生物学操作问题，提供一种自 主构建的植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T及其关键元件来源、启动子活性检测。首先，本发明提供了一种首次发现的黄瓜线粒体质粒pC3，其序列如序列表序列 1，以及含有所述质粒PC3克隆序列的质粒及相关菌株。其次，本发明提供了一种黄瓜线粒体基因cob上游启动子995bp序列，如序列表序 列2，和黄瓜线粒体基因atp9下游终止子896bp序列，如序列表序列3。以上所述黄瓜线粒体质粒pC3序列、启动子和终止子序列是构建植物线粒体通用 表达载体pSK-E-P/T中的关键性元件。第三，本发明提供了 一种含有以上所述三个关键性元件序列的植物线粒体通用 表达载体pSK-E-P/T质粒的表达盒序列，如序列表序列4，以及植物线粒体通用表达载体 pSK-E-P/T图谱及详细构建过程。第四，本发明还提供了以所述的植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T为出发质粒 构建的所有表达载体，以及含有这些植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T质粒的E. coli的 DH5a工程菌株。第五，本发明还提供了鉴定植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T启动子活性 的启动子IacZ报告基因融合质粒PDW9PC和带有绿色荧光蛋白GFP基因的表达质粒
3pSK-E-GFP。本发明的优点和有益效果本发明首次发现黄瓜线粒体质粒pC3，在此基础上，通过PCR获得黄瓜线粒体基因 cob上游启动子序列及基因atp9下游转录终止子序列，构建成植物线粒体通用表达载体 pSK-E-P/T，该载体能在大肠杆菌中复制，非常方便外源基因的克隆和重组子筛选。经测定 启动子-IacZ报告基因融合质粒在大肠杆菌中酶活性和荧光显微镜观察pSK-E-GFP转化大 肠杆菌的绿色荧光，证明表达载体上启动子具有转录活性。本发明内容提供了通过线粒体 转化途径研究细胞凋亡等与线粒体相关的重要生命科学热点问题的新型分子生物学技术 工具，推动植物线粒体基因工程理论和应用研究。
图1为重组质粒pUC-pC3-CMP构建图。图2为重组质粒pSK-CMT构建图。图3为植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T构建图。图4为融合质粒PDW9PC中线粒体cob基因启动子活性检测的β -半乳糖苷酶显 色。用pCPl和pCP2引物(详见序列表引物序列1)扩增黄瓜线粒体基因cob启动子 序列，以分别在引物PCPl和PCP2中引入的EcoRI和BamHI酶切点酶切1006bp长度的扩增 产物，并与缺失启动子的质粒Ρ·191%Ω连接，形成融合质粒pDm9PC并转化到大肠杆菌 DH5a中。以含的菌株为对照，测定含融合质粒pDm9PC菌株的β -半乳糖苷 酶活性。当向菌液中加入ONPG(邻硝基酚一B--D半乳糖苷)后，可以很清楚地看到插入了 启动子的PDW9PC融合质粒菌株与ONPG发生显色反应，颜色为黄色。图5为以植物线粒体表达质粒pSK-E-GFP转化大肠杆菌后绿色荧光蛋白检测图。A、B:依次为480nm波长蓝光激发下，视野中的pSK-E-GFP转化和非转化大肠杆菌 DH5a菌体，C、D 依次为普通光源照射下，视野中的pSK-E-GFP转化和非转化大肠杆菌DH5 a 菌体，E、F 依次为两种视场叠加后SK-E-GFP转化和非转化大肠杆菌DH5 α菌体；在荧光显微镜下分别观察经488nm波长蓝光激发后转化和未转化大肠杆菌DH5 a 菌株的发光情况，结果显示pSK-E-GFP转化的菌体发出绿色荧光；而未转化对照组菌体则 没有荧光，说明线粒体表达载体上的cob基因启动子具有转录活性。
具体实施方式实施例1 黄瓜线粒体质粒pC3的发现与其序列的克隆发明者通过电镜、Sl核酸酶消化及环形DNA分子结构与核酸电泳迁移行为的综合 分析方法，在国际上首次发现“津研四号”等一些品种黄瓜的线粒体基因组中存在550bp 的环形DNA质粒，并命名为pC3。提取“津研四号”黄瓜线粒体基因组DNA，从中分离和纯化 质粒PC3，然后对其进行Sl核酸酶消化、末端平滑化和加腺嘌呤处理，然后连接到T-Vector 上，对克隆的非全长PC3进行测序，长度为537bp，序列分析发现其中含有单一性常用限制性内切酶SmaI和XbaI位点。用SmaI消化纯化的质粒pC3并克隆到载体pUC18中，构建成 pUC-pC3/SmaI重组质粒，测序所克隆的全长pC3为550bp (详见序列表序列1)，pC3是目前 国际上发现最小的线粒体环形DNA质粒。本发明的策略就是利用pC3在黄瓜线粒体中能独 立遗传的性质，在其上装配线粒体来源的启动子和终止子，并在启动子和终止子之间引入 常用的多克隆酶切点，构建成植物线粒体通用表达载体关键的表达盒。实施例2 黄瓜线粒体基因cob上游启动子序列的获得与克隆根据GenBank已发表的黄瓜线粒体细胞色素B基因(GenBank accession numberAF288044),使用 http//www. fruitfly. org 真核生物 promoter prediction 和PlantCARE软件，分析该基因上游的转录启动子范围在1006bp之内(AF288044 2041-3047)，并在此区间设计上游引物pCMPl和下游引物pCMP2 (详见引物序列2)，以提取 的黄瓜线粒体总DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增产物经BamH I和Pst I克隆到带有黄 瓜线粒体质粒PC3的重组质粒pUC-pC3/smaI上，形成的新重组子命名为pUC-pC3_CMP (详 见说明书附图1)。对所克隆的995bp长度序列与GenBank进行比对分析，证明为预期的黄 瓜线粒体cob基因启动子序列。实施例3 黄瓜线粒体基因atp9下游转录终止子序列的获得与克隆根据 GenBank 已发表的黄瓜线粒体 atp9 基因(GenBank accession number AF288043)，使用誦.softberry. com终止子分析软件，确定转录终止子为该基因下游 896bp序歹Ij (AF288043 =9530-10426)，并设计引物pCMTl和pCMT2(详见引物序列3)，以提 取的黄瓜线粒体总DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经EcoR I和Kpn I酶切后克隆 到pSK载体上，形成的重组子命名为pSK-CMT (详见说明书附图2)，所克隆的896bp长度序 列与GenBank对比，证明为预期的黄瓜线粒体atp9基因终止子序列。实施例4 植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T的构建以SacI和PstI双酶切实施例2得到的重组子pUC-pC3_CMP，并将切下的带有黄瓜 线粒体质粒PC3和黄瓜线粒体基因cob上游启动调控序列共1. 45kb长度的片段连接到实 施例3得到的重组子pSK-CMT上(详见说明书附图3)，构建成有表达盒的植物线粒体通用 表达载体pSK-E-P/T。实施例5 启动子-IacZ报告基因融合质粒pDm9PC的构建与β -半乳糖苷酶活 性检测用pCPl和pCP2引物(详见引物1)扩增基因cob启动子序列，以EcoRI和BamHI 双酶切PCR产物并与缺失启动子的pDm91aCQ检测质粒相应的酶切点连接，形成融合质 粒pDm9PC。参考Miller的方法，分别测定pDm91ac Ω对照菌株和融合质粒pDm9PC，测 定半乳糖苷酶活性。在此过程中，当向菌液中加入ONPG后，可以很清楚地看到插入了 启动子的p_19PC融合质粒菌株与ONPG发生显色反应，颜色为黄色(详见说明书附图4)， 而对照质粒pDm91ac Ω菌株则无明显反应。pDN19PC融合质粒菌株的β -半乳糖苷酶活 性明显高于启动子缺失质粒pDm91aC Ω (20倍以上)。由于真核生物细胞器起源于原核生 物，文献报道真核生物细胞器来源的启动子和基因在原核生物具有启动和表达功能，因此， 以pDm9PC融合质粒在大肠杆菌中表达β -半乳糖苷酶活性实验间接证明了植物线粒体通 用表达载体pSK-E-P/T中cob基因启动子的活性。实施例6 带有GFP基因的表达质粒pSK-E-GFP构建与绿色荧光检测
本实验室保留的质粒pET32-GFP中带有发光水母(Aequorea Victoria)来源 的绿色荧光蛋白基因GFP (717bp)，且该基因两端为EcoR I酶切位点。用EcoR I从载体 PET32-GFP上切下GFP基因序列并回收。同时用EcoR I酶切载体pSK_E_P/T，将GFP基因 克隆到表达载体pSK-E-P/T上。分别用EcoR I和Sal I酶切重组子以GFP基因的检测连 接方向。挑选EcoR I酶切检测时能切出一条约730bp GFP目的带，且用Sal I酶切能切出 一条约IOObp目的带的正向连接重组子，命名为pSK-E-GFP。用电转化方法将线粒体表达载 体质粒pSK-E-GFP导入大肠杆菌DH5 α中，分别取转化和非转化菌液置于载玻片进行显微 观察。在荧光显微镜下经488nm波长蓝光激发后明显地观察到转化菌体发出绿色荧光，而 对照组大肠杆菌DH5ci菌株则没有荧光(详见说明书附图5)。由此证明线粒体表达载体上 的cob基因启动子具有转录活性。
权利要求
一种黄瓜线粒体质粒pC3，其序列如序列表序列1。
2.一种含有权利要求1所述质粒pC3克隆序列的质粒及相关菌株。
3.—种黄瓜线粒体基因cob上游启动子995bp序列，如序列表序列2。
4.一种黄瓜线粒体基因atp9下游终止子896bp序列，如序列表序列3。
5.一种含有权利要求1、3和4所述序列的植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T质粒的 表达盒序列，如序列表序列4。
6.一种所含有权利要求5所述植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T质粒的E. coli的 DH5a工程菌株。
7.权利要求5所述植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T的图谱。
8.以权利要求5所述的植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T为出发质粒构建的所有表 达载体。
全文摘要
一种植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T构建及启动子活性鉴定。本发明首次发现黄瓜线粒体质粒pC3(序列1)，在此基础上，通过PCR获得黄瓜线粒体基因cob上游启动子序列(序列2)及基因atp9下游终止子序列(序列3)，构建成植物线粒体通用表达载体pSK-E-P/T(序列4)，该载体上还带有在大肠杆菌中复制的复制子及Ampr抗性基因，非常方便外源基因的克隆和重组子筛选。经测定启动子-lacZ报告基因融合质粒在大肠杆菌中酶活性和荧光显微镜观察pSK-E-GFP转化大肠杆菌的绿色荧光，证明表达载体上启动子具有转录活性。本发明提供了通过线粒体转化途径研究细胞凋亡等与线粒体相关的重要生命科学热点问题的新型分子生物学技术工具。
文档编号C12N1/21GK101974560SQ20101051120
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日 公开号201010511206.发明者乔明强, 周腊梅, 张秀明, 徐海津, 白艳玲, 董荣 申请人:南开大学