专利名称：一种发根农杆菌k599介导的菊花转基因方法
一种发根农杆菌K599介导的菊花转基因方法
(-)技术领域 本发明涉及一种发根农杆菌K599介导的菊花转基因方法。 背景技术：
菊花(Dendranthema morifolium)属于菊科菊属的植物，原产我国，是我国十 大传统名花和世界四大切花之一，也是集文化意义和经济价值于一体的名品花卉，并 有食用和药用价值(戴思兰等，菊属系统学及菊花起源的研究进展，北京林业大学学 报，2002，24(5/6) 230-234)。株形、花型和花色是影响菊花等花卉品质的重要的 因素，而植物转基因技术在改良花卉品质中起着重要作用，邵寒霜等、Petty等、Zheng 等先后报道利用转基因技术将lef、phyA、Phy B_1等基因转入菊花，使菊花的形态 和花期等发生了改变(邵寒霜等，拟南芥LFY cDNA的克隆及转化菊花的研究，植物 学 艮，1999， 41(3) 268-271 ； Pettyetal, Modifying chrysanthemum (Dendranthema grandifloram)growth habit genetic manipulation, Acta Hort, 2000, 508 319—321; Zheng et al，Modification of plant architecture inchrysanthemum by ecotopic expression of the tabacco phytochrome Bl gene, J Amer Soc Hort Sci，2001，126(1) 19-26)。对于株型，用 于盆栽或地被用途的菊花，往往需要植株矮化、分枝性强、着花数目多等特征。目 前，改变观赏植物的株形，常用的基因是来自发根农杆菌Ri质粒的rol基因(Zukeret al, rolC-transgenic carnation with improved horticultural traits quantitative and qualitative analysis of greenhouse-grown plants，J Am SocHort Sci, 2001, 126 13-18)。 Kiyokawa 等将发根农杆菌rolA、B、C基因转入了球根秋海棠中，结果观察到植株矮化、延迟开 花，叶禾口花辧均变自皮(Kiyokawa et al, Genetic transformation of Begonia tuberhybrida by Ri rolgenes, Plant Cell Reports, 1996，15 (8) : 606-609)。Handa 等将 rol 基因导入龙胆属 植物草龙胆(prairie gentian)中，除了观察到转基因植株矮化、叶变皱之外，还观察到花 冠呈杯状变化(Handa et al, Genetic transformationof Eustoma grandifiorum with rol gene, Acta Hort, 1995，392 209-218)。Zuker等用基因枪和根癌农杆菌相结合的方法，将 rol基因导入香石竹中，rol基因减少了香石竹腋芽的产生，增强发根的能力。Dolgov 等将rolC基因导入菊花品种‘White Snowdon’中，获得两个转化系，其中有一个系与 对照相比，表现为丛生、矮化，并且叶多分裂(Dolgov et al，Agrobacterialtransformation of chrysanthemum, Acta Hort，1997，447 329-334)。此外，有研究报道利用农杆菌 转基因法将不同功能的目的基因转入菊花(傅荣昭和刘敏，通过根癌农杆菌介导法获得 菊花转基因植株，植物生理学报，1998，24(1) 72-76 ；王关林等，雪花莲凝集素基 因转化菊花及转基因植株的抗蚜性研究，遗传学报，2004，31(12) 1434-1438 ；洪波 等，AtDREBlA基因在菊花中的异源表达提高了植株对干旱和盐渍胁迫的耐性，中国科 学(C辑)，2006，36(3) 223-231 ；洪波等，地被菊花Fall Color体细胞胚途径再生， 遗传转化及转基因植株的抗寒性检测，中国农业科学，2006，39(7) 1443-1450 ；孙 磊等，利用双T-DNA载体系统获得无选择标记转基因菊花，园艺学报，2008，35(5)727-734，姜丹等，拟南芥花期基因FT转化切花菊‘神马，，园艺学报，2010，37(3) 423-430)，但上述报道中菊花的再生效率偏低。
发明内容
本发明目的是提供一种菊花再生效率高的发根农杆菌K599介导的菊花转基因方法。本发明采用的技术方案是一种发根农杆菌K599介导的菊花转基因方法，所述方法包括(1)将发根农杆菌K599菌液侵染菊花无菌苗叶片或叶腋，诱导形成转基因不定 根；侵染形成转基因不定根可按照常规方法进行，具体方法可如下将高5 8cm菊花 组织培养无菌苗植株，中部以上的叶片用解剖刀划出或者用解剖剪剪出长0.5 Icm伤口，用微量进样器吸取15 20 μ L农杆菌菌液滴加于叶片伤口处或者叶腋处，或者用 5mL容量的无菌注射器吸取5 10 μ L农杆菌菌液，将针头插入叶片或叶腋处，再将菌液 注入。(2)当转基因不定根生长到2cm以上后，从顶端剪取0.4 0.8cm长度的转基因 不定根，转入继代培养基进行繁殖，每隔15 20天剪取长度0.4 0.8cm的转基因不定 根顶端转入新的继代培养基，按此方法进行继代培养2 3代后再转入诱导培养基进行诱 导培养，将诱导出的愈伤组织转入分化培养基进行分化培养，将分化出的苗转入生根培 养基形成带根的完整植株；所述继代培养基为添加500mg/L头孢霉素的MS培养基；所述诱导培养基为添加0.5mg/L 6_苄氨基嘌呤+lmg/L萘乙酸的MS培养基；所述分化培养基为添加2mg/L 6-苄氨基嘌呤的MS培养基；所述生根培养基为添加0.5mg/L生长素的MS培养基；上述培养均在带盖培养瓶中进行；(3)分化出的完整植株长至5 6cm时，打开培养瓶盖练苗3d后，再移栽到泥炭砻糠灰珍珠岩体积比3 1 1的土壤中，在自然条件下生 长，获得转基因菊花。所述步骤(1)中发根农杆菌K599可为野生型发根农杆菌K599，也可以为带有目 的基因的发根农杆菌K599，所述带有目的基因的发根农杆菌K599由含有目的基因的质 粒导入野生型发根农杆菌K599获得。所述目的基因可为本领域常规用于改善菊花形态、 花期或株形的基因。有不少报道指出，在含有植物激素的培养基上，离体的叶片和茎在培养过程中 自身会产生非转基因的不定根(林规等，影响月季愈伤组织诱导和分化的因素，分子植 物育种，2006，4(2) 223-227 ； Nolanetal, Auxinup-ulates MtSERKl expression in both Medicago trancatula root-forming andembryogenic cultures, Plant Physiol, 2003, 133(1) 218-230)，发明人在进行菊花叶片和茎的离体培养实验中也观察到这种情况；而利用活 体生长状态下的菊花叶片和叶腋作为农杆菌侵染的对象，经过PCR检测获得的不定根均 为转基因不定根，因此，利用活体材料直接作为农杆菌诱导不定根的受体，可以有效克 服假阳性转基因不定根的出现。此外，在农杆菌转基因过程中，外植体与农杆菌共培养后必须使用抗生素抑制直至杀灭农杆菌，通常使用的抗生素是浓度为250 IOOOmg/ L的头孢霉素。Yepes等观察到头孢霉素对菊花的外植体再生有毒害作用，会抑制植 株的分化(Yepes etal， Agrobacterium tumefaciens versus biolistic-mediated transformation of thechrysanthemum cvs.Polaris and Golden Polaris with nucleocapsid proteingenes of three Tospoviras species, International Symposium on Cut Flowers inthe Tropics species, Acta Hort, 1999，482 209-218)。本发明中利用不定根繁殖过程中顶端生长点区域无菌的特 点，通过截取不定根顶端靠近生长点区域进行继代培养2 3次，结合使用头孢霉素杀 菌，能很好地抑制和杀灭发根农杆菌，因此，在随后的不定根诱导愈伤及分化过程中无 须再使用抗生素(头孢霉素)杀菌，从而有效提高了转基因再生效率。
虽然目前已经有报道利用农杆菌介导法以及基因枪法获得了转基因菊花，但其 转化效率仍然不高。本发明利用发根农杆菌K599对菊花切割的叶片和未切割的叶腋进 行活体感染生根，其生根频率分别达88%和60%，不定根的愈伤组织诱导率和愈伤组织 再生率分别达75%和63.3%。并且，获得的转基因植株实现了来源于K599Ri质粒的外 源rolC的高效表达，这为进一步进行菊花矮化育种和目标基因的转移提供了一个良好的 实验体系。本发明利用活体植物材料直接作为发根农杆菌K599侵染的受体诱导不定根，其 有益效果主要体现在能克服假阳性不定根的出现；同时，利用不定根繁殖过程中顶端 生长点区域无菌的特点，通过截取不定根顶端靠近生长点区域进行继代培养，结合使用 头孢霉素杀菌，能达到有效抑制和杀灭农杆菌的目的，在随后的不定根诱导愈伤及分化 过程中无须再使用抗生素杀菌，提高了转基因再生效率。本发明利用发根农杆菌K599对 菊花活体进行不定根的诱导和实现不定根的再生，为菊花的矮化育种和目标基因的转移 提供了良好的实验方法。
图1为发根农杆菌K599对菊花活体侵染形成转基因不定根及转基因不定根的 再生植株A:无菌苗叶片被K599活体侵染生根；B:无菌苗叶腋被K599活体侵染生 根；C:转基因不定根组织培养形成愈伤组织；D:转基因不定根组织培养再生完整植 株；E移栽成活的转基因植株。图2为转基因毛状根和再生的植株进行PCR扩增结果；M 1 Kb IadderDNA分
子量标记；1 3 转基因毛状不定根；4 非转基因根；5 7 转基因再生植株；8 非转基因植株；9:发根农杆菌K599Ri质粒。图3为rolC基因在菊花野生型和转基因植株中的表达分析；WT 非转基因菊 花；T01，T02和T03:转基因菊花。图4为利用发根农杆菌K599介导获得的菊花转gi^D基因的不定根。图5为利用发根农杆菌K599介导获得的菊花转gi^D基因的再生植株。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限 于此
实施例1 材料与方法1农杆菌菌株及其培养实验用菌种为野生型发根农杆菌K599 (购自the National Collection ofPlant Pathogenic Bacteria in U.K.)。将-80 °C保存的菌种在LB+Str (链霉素)50mg/L的固体培养 基上划线、28°C过夜培养，挑取单菌落在LB+Str (链霉素)50mg/L的液体培养中、230 250r/min、28°C过夜培养，生长旺盛的菌液用作进一步实验。2菊花材料 以菊花(小紫菊，购自杭州花卉市场)组织培养无菌苗作为发根农杆菌K599感 染诱导毛状不定根的受体材料。3毛状不定根的诱导将过夜培养生长旺盛的发根农杆菌K599用LB培养基离心清洗两次后重悬于LB 培养基中，调光密度(OD6tltl)到0.5左右。将高5 8cm菊花组织培养无菌苗植株，中部 以上的叶片用解剖刀划出或者用解剖剪剪出长0.5 Icm伤口，用微量进样器吸取15 20 μ L农杆菌菌液滴加于叶片伤口处或者叶腋处，或者用5mL容量的无菌注射器吸取5 10 μ L农杆菌菌液，将针头插入叶片或叶腋处，再将菌液注人。随后菊花植株继续培养。4毛状不定根的培养和再生当不定根生长到2cm以上后，从顶端剪取不定根约0.5cm，转入MS (0)+500mg/ L Cef (头孢霉素)(即MS培养基添加500mg/L Cef)上繁殖，每隔15 20天剪取不定根 0.5cm左右的顶端转入新的培养基上，培养2 3代后再转入不含头孢霉素的MS+6-BA 0.5mg/L+NAA lmg/L诱导培养基上诱导愈伤组织，30d后将诱导出的愈伤组织转入 MS+6-BA 2mg/L上进行分化，最后将分化出的苗转入MS+IAA 0.5mg/L培养基上形成带 根的完整植株。分化出的完整植株长至5cm左右，打开培养瓶盖练苗3d，再移栽到含泥 炭砻糠灰珍珠岩(体积比3 1 1)的盆钵中，在自然条件下生长。5农杆菌K599质粒、毛状不定根和再生植株DNA的提取农杆菌K599质粒DNA的提取同向太和等的方法(向太和等，野生型发根农杆 菌K599的解毒，遗传，2001，23(4) 336-340)。提取毛状不定根和再生植株DNA的 方法是剪取少量毛状根或叶片放入2mL Eppendorf离心管中，加液氮速冻后用玻璃棒捣 碎，力口 750 μ L DNA抽提液(100mmol/L Tris-HCl, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS)，60°C水浴Ih后加等体积的氯仿乙醇异戊醇(体积比为80 16 4)混 合液，室温静置30min，期间来回颠倒数次，4°C、11000r/min下离心lOmin，取上层液 相用等体积的异丙醇沉淀，再用70%乙醇在4°C、6000r/min下离心5min清洗2次，室温 干燥后溶于20 μ L无菌ddH20贮于_20°C备用。6转基因毛状不定根和再生植株的PCR鉴定根据 Furner 等发表的 rolC 基因序列(Furner etal, An Agrobacteriumtransformation in the evolution of the genus Nicotiana，Nature, 1986，319 422-427),设计并合成扩增 rolC 的 PCR 引物。rolC 引物为rolC-Pl 5 ‘ -CTCCTGACATCAAACTCGTC-3 ‘； P2 5' -TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3‘。PCR扩增参数如下起始变性 94°C 5min 后，接着进行35个循环，每个循环包括94°C变性45s，56°C退火45s和72°C延伸反应90s，最后在72°C延伸lOmin。扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳、120V lh，EtBr(溴 化乙锭)染色，用凝胶成像系统(Bio/Rad公司)进行拍照记录和分析。7再生植株qRT-PCR分析 用RNA提取试剂盒(TaKaRa公司)提取转基因植株和对照非转 基因植株叶片 mRNA，用 SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TaKaRa 公 司)进行RT-PCR扩增。根据菊花actin基因序列(GenBank登记号 AB205087)设计弓 | 物，actin-Pl 5 ‘ -ACAACTGGCATTGTGTTGGA-3 ‘ 禾口 actin_P2 5 ‘ -CAGGACATCTGAAACGCTCA-3 ‘, 扩增结果作 为内参。根据rolC基因序列(GenBank登记号X03432)设计引物， rolC-qPl 5 ‘ -AAGAAAGTGCGGCGAAGTAA — 3 ‘ 禾Π rolC_qP2 5' -ATCTCAGGGTCAAGGACGTG-3 ‘，进行 rolC 基因的定量分析，用 Strategene 公 司MX3000P型荧光定量PCR仪进行扩增。荧光定量PCR条件是起始95°C 2min,随后 95°C30s、59°C30s、72°C 20s 进行 40 循环，结束后在 4°C保存。参考 Schmittgen和 Livak 的方法计算 rolC 基因相对表达量(Schmittgen and Livak, Analyzing real-time PCR data by thecomparative C (T) method, Nat Protoc, 2008，3(6) 1101-1108)。结果1毛状不定根的诱导发根农杆菌K599侵染菊花植株叶片的伤口以及叶腋处，在IOd左右形成肉眼可 见的毛状根(图1A，B)，K599侵染切割的叶片和未受伤的叶腋诱导根的频率分别为88% (44/50)和60% (30/50)，生根频率叶片>叶腋。而对照未滴加K599菌液的叶片的伤口 处以及腋芽处均没有出现生根现象。2毛状不定根的培养和植株再生从顶端剪取长0.5cm左右不定根，在转入MS+500mg/L Cef(头孢霉素)上能 快速增殖，15 20d即可生长到2cm以上，从顶端剪取快速增殖的不定根0.5cm左右转 入新的培养基上，经过2 3代培养后可以达到有效除菌效果，再转入不含头孢霉素的 MS+6-BA 0.5mg/L+NAA lmg/L诱导培养基上诱导愈伤组织，在诱导培养基上培养1周 后可以看到根的切口处膨大突起形成黄绿色的愈伤组织，愈伤组织结构紧密，诱导率为 75% (60/70)。30d后将愈伤组织转入MS+6-BA 2mg/L上进行分化，分化出绿色苗， 最后转入MS+IAA0.5mg/L培养基上形成具有根的完整植株，愈伤组织分化频率为63.3% (19/30)。再生植株经过练苗后移栽成活，并能正常开花(图1C，D，E)。再生植株形 态表现为矮缩、具有毛状根等特征。3毛状不定根以及再生植株中rolC基因的PCR扩增检测提取诱导出的不定根和再生的植株DNA，利用根据rolC基因序列设计的PCR弓丨 物，从诱导形成的毛状根以及再生植株DNA中均扩增到期望的770bp左右的特异性DNA 片段，该片段与从发根农杆菌K599的Ri质粒DNA中扩增出的特异性片段大小相同；而 非转化根和非转化菊花叶片DNA未扩增出任何条带(图2)。表明野生型发根农杆菌K599 的Ri T-DNA已整合到诱导的毛状根基因组中，并且由不定根再生的植株为转基因植株。4再生植株rolC基因的qRT-PCR分析以aclin基因作为内参对照，荧光定量PCR(qRT-PCR)分析显示，rolC基因在转基因植株(T01、T02、T03)中实现了高效表达，而在野生型的非转基因植株(WT)中未 检测到表达信号(图3)。实施例2 (1)用冻融法将带有荧光蛋白质基因gfp的质粒pBIN-35S-GFP(pBIN-35S_GFP 构建方法见文献徐纪明，向太和，含gfp植物转基因表达载体的构建及在矮牵牛转基 因不定根中的高效表达，遗传，2008，30(8) 1069-1074)导入发根农杆菌K599，即 在50 μ L Κ599感受态细胞中加入约0.1 μ g纯化质粒pBIN_35S_GFP，混勻后在冰上放 置lOmin，置于液氮速冻5min，立即用28°C水浴热激5min，加入500 μ L LB液体培养 基，在28°C缓慢振荡培养2h。取ΙΟΟμ L菌液分别涂布于LB+Km(卡那霉素)50mg/ L+Str(链霉素)50mg/L固体培养基上，28°C培养约48h筛选抗性菌落，获得带有质粒 pBIN-35S-GFP的发根农杆菌K599。
(2)以菊花组织培养无菌苗作为发根农杆菌K599/pBIN-35S_GFP感染诱导毛状 不定根的受体材料。将过夜培养生长旺盛的发根农杆菌K599/pBIN-35S_GFP用LB培 养基离心清洗两次后重悬于LB培养基中，调光密度(OD_)到0.5左右。将高5 8cm 菊花组织培养无菌苗植株，中部以上的叶片用解剖刀划出或者用解剖剪剪出长0.5 Icm 伤口，用微量进样器吸取15 20 μ L农杆菌菌液滴加于叶片伤口处或者叶腋处，或者用 5mL容量的无菌注射器吸取5 10 μ L农杆菌菌液，将针头插入叶片或叶腋处，再将菌 液注人。随后菊花植株继续培养。在IOd左右形成肉眼可见的毛状根。获得菊花转gfp 基因的不定根，用ZEISS显微镜(型号Axio imager)，在蓝色激发光下(滤光片FITC) 对诱导出的不定根进行荧光检测，不定根在荧光显微镜下发出强烈的绿色荧光(图4)， 表明gfp基因已得到高效表达。(3)从顶端剪取长0.5cm左右不定根，在转入MS (0) +500mg/L Cef (头孢霉素) 上增殖，15 20d即可生长到2cm以上，从顶端剪取快速增殖的不定根0.5cm左右转入新 的培养基上，经过2 3代培养后达到有效除菌效果，再转入不含头孢霉素的MS+6-BA 0.5mg/L+NAA lmg/L诱导培养基上诱导愈伤组织，在诱导培养基上培养1周后可以看到 根的切口处膨大突起形成黄绿色的愈伤组织，愈伤组织结构紧密。30d后将愈伤组织转入 MS+6-BA 2mg/L上进行分化，分化出绿色苗，最后转入MS+IAA 0.5mg/L培养基上形成 具有根的完整植株(图5)。再生植株经过练苗后移栽成活，并能正常开花。
权利要求
1.一种发根农杆菌K599介导的菊花转基因方法，所述方法包括(1)将发根农杆菌K599菌液侵染菊花无菌苗叶片或叶腋，诱导形成转基因不定根；(2)当转基因不定根生长到2cm以上后，从顶端剪取0.4 0.8cm长度的转基因不定 根，转入继代培养基进行繁殖，每隔15 20天剪取长度0.4 0.8cm的转基因不定根顶 端转入新的继代培养基，按此方法进行传代培养2 3代后再转入诱导培养基进行诱导培 养，将诱导出的愈伤组织转入分化培养基进行分化培养，将分化出的苗转入生根培养基 形成带根的完整植株；所述继代培养基为添加500mg/L头孢霉素的MS培养基； 所述诱导培养基为添加0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+lmg/L萘乙酸的MS培养基； 所述分化培养基为添加2mg/L 6-苄氨基嘌呤的MS培养基； 所述生根培养基添加0.5mg/L生长素的MS培养基； 上述培养均在带盖培养瓶中进行；(3)分化出的完整植株长至5 6cm时，打开培养瓶盖练苗3d后，再移栽到泥炭 砻糠灰珍珠岩体积比3 1 1的土壤中，在自然条件下生长，获得转基因菊花。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中发根农杆菌K599为带 有目的基因的发根农杆菌K599，由含有目的基因的质粒导入野生型发根农杆菌K599获得。
全文摘要
本发明提供了一种菊花再生效率高的发根农杆菌K599介导的菊花转基因方法，所述方法是利用活体植物材料直接作为发根农杆菌K599侵染的受体诱导不定根(以发根农杆菌K599菌液侵染菊花叶片伤口处或者叶腋处)，不定根再诱导愈伤组织进行分化培养获得完整植株，其有益效果主要体现在能克服假阳性不定根的出现；同时，利用不定根繁殖过程中顶端生长点区域无菌的特点，通过截取不定根顶端靠近生长点区域进行继代培养，结合使用头孢霉素杀菌，能达到有效抑制和杀灭农杆菌的目的，在随后的不定根诱导愈伤及分化过程中无须再使用抗生素杀菌，提高了转基因再生效率。
文档编号C12N15/82GK102010877SQ20101051110
公开日2011年4月13日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者向太和, 王琳, 田璟鸾, 蒋欢 申请人:杭州师范大学