一种与临床原因不明的弱精子症相关的线粒体dna的snp标志物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程及生殖医学领域，公开了一种与临床原因不明的弱精子症相关的线粒体DNA的SNP标志物及其应用。该标志物为C5601T，T12338C，A12361G，G13928C，A15851G，C16179T，G16291A的组合，可用于制备临床原因不明的弱精子症辅助诊断试剂盒，具有较好的特异性和灵敏度。
【专利说明】—种与临床原因不明的弱精子症相关的线粒体DNA的SNP标志物及其应用
发明领域
[0001]本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及一种与临床原因不明的弱精子症相关的线粒体DNA的SNP标志物及其应用。
【背景技术】
[0002]全世界约有8 — 15%的育龄夫妇具有不同程度的生育障碍，其中男方因素约占50%。研究表明，半个多世纪以来，人类精液质量显著下降，目前认为男性不育的发生是一个多因素、多阶段的过程，是环境危险因素(外因)和个体遗传因素(内因)共同作用的结果。其中，个体遗传因素包括染色体遗传因子改变，表观遗传修饰异常及线粒体基因组遗传结构变异。线粒体基因组作为核外唯一的基因组，其遗传结构变异被认为是男性不育最重要的遗传病因之一。
[0003]线粒体(mitochondria)是一个复杂的细胞器,为细胞发挥功能所需能量的主要来源。线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是一个双链闭合环状分子，包括了 16569个碱基对(登录号为NC_012920.1 )，其上37个基因负责编码13个呼吸链酶复合物亚基，22种转运RNA (tRNA)和2种核糖体RNA (rRNA)。由于缺少组蛋白的保护和DNA修复系统，mtDNA的突变率是核DNA的10-100倍。ATP是精子活力的首要能量来源，它主要来自两个途径:无氧酵解和线粒体呼吸链OXPHOS (有氧氧化)途径。经典的理论认为精子中段线粒体形成的线粒体鞘在精子 运动过程中供给所需能量，凡影响ATP生成的任何因素，如呼吸酶抑制剂等均可直接或间接影响精子活力。研究证明，获能前的精子主要依赖无氧酵解供能，这个过程不需线粒体参加。精子获能以后代谢活动明显增强，表明精子线粒体中OXPHOS产生大量ATP，精子出现一种特异的“鞭打样”运动方式，通过此种运动方式，精子穿过卵子透明带而受精。由此可见，当活性氧(ROS)等自由基对mtDNA的攻击导致氧化损伤或mtDNA突变影响ATP的产生时，必将影响精子活力，导致生育障碍。
[0004]目前，弱精子症(asthenospermia)的初步诊断方法主要为病史询问、体格检查、精液参数、精浆生化、血性激素检测、B超以及染色体检测等。世界卫生组织在男性不育的诊断检查及处理手册指明:弱精子症是指精液参数中前向运动的精子(a和b级)小于50%或a级运动的精子小于25%的病症，弱精子症又称精子活力低下。常规的精子活力分析目前主要依靠精子活力判别(人工计数或利用计算机辅助系统分析，即CASA)，尚无其他有效的手段，但其自身存在一定的缺陷，如个体精液质量波动较大，尤其易受到禁欲天数、温度、采集精液方法等因素的影响，从而造成精子活力测量不准确；对相应疾病的早期诊断效果也远不能满足需要。尽管目前国内外研究者正努力探索新的弱精子症诊断生物标志物，并对现有评估手段进行有效的补充，但一直难以突破传统生物标志物发展和男性生殖实际应用中的瓶颈，即精液质量分析结果波动、早期诊断困难等。此外，由于病因不明，缺乏有效的治疗手段，大多数弱精子症病人只能选择ICSI或AID等辅助生育手段，不仅无法满足心理上的要求，而且有可能出现后代的遗传缺陷。[0005]研究表明，遗传因素是引起男性不育的主要因素，线粒体遗传变异在其中起重要作用。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。遗传变异的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性，因此遗传变异可能是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。目前还没有将线粒体DNA遗传变异应用于弱精子症诊断的报道，若能筛选出弱精子症易感的线粒体DNA遗传变异作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对弱精子症的诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与临床原因不明的弱精子症辅助诊断相关的线粒体DNA遗传变异标志物及含有该标志物的基因。
[0007]本发明的第二个目的是提供上述线粒体DNA遗传变异标志物的特异性扩增引物。
[0008]本发明的第三个目的是提供上述线粒体DNA遗传变异标志物的特异性延伸引物。
[0009]本发明的第四个目的是提供上述线粒体DNA遗传变异标志物及其特异性扩增引物和特异性延伸引物在制备弱精子症辅助诊断试剂盒中的应用。
[0010]本发明的第五个目的是提供弱精子症辅助诊断试剂盒。
[0011]发明人通过分离和研究临床原因不明的弱精子症患者及与其年龄匹配的健康男性对照外周血线粒体DNA遗传变异(SNP)，寻找一组与弱精子症高度相关的高特异性和敏感性的线粒体DNA遗传变异，并研制出可便于临床应用的弱精子症辅助诊断试剂盒，为临床原因不明的弱精子症的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
[0012]本发明的目的是通`过下列技术方案实现的:
[0013]一种与临床原因不明的弱精子症辅助诊断相关的线粒体DNA的SNP标志物，该SNP标志物为线粒体 DNA 的 C5601T, T12338C, A12361G, G13928C, A15851G, C16179T, G16291A。
[0014]一种与临床原因不明的弱精子症辅助诊断相关的基因，该基因的序列为登录号为NC_012920.1 的线粒体 DNA 序列中存在下列 SNP:C5601T, T12338C, A12361G, G13928C, A15851G, C16179T, G16291A0
[0015]用于检测所述的线粒体DNA遗传变异标志物的特异性扩增引物，这些引物为:
[0016]C5601T 的引物序列为 SEQ ID No:l 和 SEQ ID No: 2 ;T12338C 的引物序列为 SEQ IDNo:4 和 SEQ ID No:5 ;T12361G 的引物序列为 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 ;G13928C 的引物序列为 SEQ ID No: 10 和 SEQ ID No: 11 ;A15851G 的引物序列为 SEQ ID No: 13 和 SEQ IDNo:14 ;C16179T 的引物序列为 SEQ ID No: 16 和 SEQ ID No: 17 ;G16291A 的引物序列为 SEQID No:19 和 SEQ ID No:20。
[0017]用于检测所述的线粒体DNA遗传变异标志物的特异性延伸引物序列，这些延伸引物序列为:
[0018]C5601T的延伸引物序列为SEQ ID No:3 ;T12338C的延伸引物序列为SEQ IDNo:6 ;A12361G的延伸引物序列为SEQ ID No:9 ;G13928C的延伸引物序列为SEQ ID No:12 ；A15851G的延伸引物序列为SEQ ID No: 15 ;C16179T的延伸引物序列为SEQ ID No: 18;G16291A的延伸引物序列为SEQ ID No:21。[0019]所述的SNP标志物在制备临床原因不明的弱精子症辅助诊断试剂盒中的应用。
[0020]所述的基因在制备临床原因不明的弱精子症辅助诊断试剂盒中的应用。
[0021]所述的特异性扩增引物和/或特异性延伸引物在制备临床原因不明的弱精子症辅助诊断试剂盒中的应用。
[0022]一种临床原因不明的弱精子症辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中C5601T, T12338C, A12361G, G13928C, A15851G, C16179T, G16291A。
[0023]所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有所述的特异性扩增引物和/或所述的特异性延伸引物。
[0024]所述诊断试剂盒，该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。
[0025]具体地说，本发明解决问题的技术方案包括:(1)建立统一标准的标本库和数据库:以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测:选择临床原因不明的弱精子症病例、与临床原因不明的弱精子症病例年龄匹配的健康男性对照，利用Illumina测序技术，在线粒体全基因组范围内找出与临床原因不明的弱精子症相关的线粒体DNA遗传变异。(3)对筛选出的阳性关联线粒体遗传变异，进一步在大样本人群中进行检测，以判断其关联的稳定性。(4)弱精子症辅助诊断试剂盒的研制:根据弱精子症病例和健康男性对照中基因型分布频率有显著差异的线粒体遗传变异开发线粒体遗传变异辅助诊断试剂盒。
[0026]本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了 Illumina测序技术进行线粒体全基因组扫描，SNaPshot基因分型进行单个位点的检测等。
[0027]具体来说研究的实 验方法主要包括以下几个部分:
[0028]1.研究样本的选择
[0029](I)重复精液质量检测，确诊为弱精子症；
[0030](2)性功能正常；排除具有隐睾症病史、睾丸炎、输精管梗阻、输精管切除术、多染色体异常及Y染色体无精子症因子微缺失等具有已知病因的患者
[0031](3)与病例年龄匹配的健康男性对照
[0032]本研究共采用1724例符合标准的样本进行研究。
[0033]2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20_50ng/μ IDNA，纯度(紫外2600D与2800D比值)在1.6-2.0。
[0034]3.线粒体DNA基因组全测序
[0035](I)取受试者全基因组DNA样本；
[0036](2)利用Illumina测序技术进行线粒体全基因组扫描；
[0037](3)检测并比较各基因型在弱精子症病例与健康男性对照中的分别差异。
[0038]4.遗传变异位点的SNaPshot基因分型
[0039](I)取受试者DNA样本；
[0040](2)设计单个遗传变异的特异性多重PCR引物和单碱基延伸引物；
[0041](3)进行多重PCR反应和延伸反应；
[0042](4)检测并比较临床原因不明的弱精子症病例与健康男性对照中不同基因型的分
布差异。[0043]5.诊断试剂盒制备方法
[0044]利用Illumina测序技术进行全基因组扫描和单个遗传变异检测后确定临床原因不明的弱精子症病例与健康男性对照中基因型分布频率有显著差异的遗传变异，作为临床原因不明的弱精子症诊断的指标。最后筛选出的与临床原因不明的弱精子症发病有关的遗传变异组成辅助诊断试剂盒(用于检测C5601T，T12338C, A12361G, G13928C, A15851G, C16179T, G16291A)。诊断试剂可以包括这些变异位点的特异性引物和特异性延伸引物，以及Taq酶、dNTP等试剂。
[0045]6.统计分析方法 [0046]运用卡方检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用Logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。
[0047]为了进一步研究这7个遗传变异构成的综合指征用于早期诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个遗传变异位点与临床原因不明的弱精子症发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个遗传变异位点的二种基因型进行评分，野生纯合型=“0”，变异纯合型=“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下:危险分值=(0.95XC5601T 的评分)+ (1.18 X T12338C 的评分)+ (1.00 X A12361G 的评分)+ (0.48XG13928C 的评分)+ (1.30XA15851G 的评分)+ (1.10XC16179T 的评分)+(0.90XG16291A的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于全基因组关联研究的470例样本中。(以C5601T为例:0.95为C5601T变异位点的回归系数(见表1);C5601T的评分，由于线粒体只有2种基因型，若这个点为CC (野生纯合型)则赋值为O分，若为TT(变异纯合型)则赋值为2分。某个SNP是野生纯合型还是变异纯合型由仪器检测结果确定；某个样本的总评分是这7个SNP分别评分的总和，单个SNP的基因型只是计算评分的一个中间过程，不需要知道具体基因型。)
[0048]统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
[0049]以下是本发明进一步的说明:
[0050]在236例符合条件的临床原因不明的弱精子症病例及234例健康男性对照中，两组年龄均衡可比。我们将这两组人群经Illumina测序技术进行线粒体全基因组扫描获得相关结果。
[0051]根据全基因组检测结果，本发明人检测到在“临床原因不明的弱精子症病例”组和“健康男性对照”组中基因型分布频率存在差异的遗传变异包括:C5601T，T12338C，A12361G，G13928C, A15851G, C16179T, G16291A。
[0052]根据上述检测结果，我们将这7个与临床原因不明的弱精子症发病相关的遗传变异在另外688例临床原因不明的弱精子症病例和与其年龄匹配的566例健康男性对照中进行了单个遗传变异的检测，结果与全基因组检测一致。
[0053]单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明，这7个遗传变异与临床原因不明的弱精子症的发病存在着显著关联，7个遗传变异均是危险因素，变异等位基因可增加临床原因不明的弱精子症的发病风险。[0054]进一步分析这7个遗传变异的组合用于临床原因不明的弱精子症诊断的效果，发现其组合能够很好的区分病例与对照。
[0055]根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于临床原因不明的弱精子症辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述遗传变异的特异性引物、特异性延伸引物和/或其他检测试剂。
[0056]具体而言，这7个遗传变异的组合，或者这7个遗传变异的特异性引物及特异性延伸引物的组合构成的相关诊断试剂盒有助于临床原因不明的弱精子症的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
[0057]本发明有益效果:
[0058]本发明提供的遗传变异标志物作为临床原因不明的弱精子症辅助判断的标志物的优越性在于:
[0059]( I)遗传变异位点是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物,稳定、微仓IJ、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为临床原因不明的弱精子症的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
[0060](2)遗传变异位点试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于临床原因不明的弱精子症的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
[0061](3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全基因组测序以获取疾病相关的遗传变异谱，并应用SNaP`shot基因分型方法在大样本中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了遗传变异生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
[0062]本发明通过控制年龄等对疾病发展的影响因素，研究遗传变异在临床原因不明的弱精子症辅助诊断的应用前景，阐述遗传变异对于临床原因不明的弱精子症进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明获得了临床原因不明的弱精子症发病相关遗传变异谱和特异性标志物；通过遗传变异生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得临床原因不明的弱精子症的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
【专利附图】
【附图说明】
[0063]图1为健康男性对照组和临床原因不明的弱精子症病例组之间的ROC曲线。【具体实施方式】
[0064]实施例1样品的收集和样品资料的整理
[0065]发明人于2007年6月4月开始至2011年I月从南京医科大学生殖医学中心收集了大量的临床原因不明的弱精子症患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了 1724例符合下列标准的样本全基因组芯片扫描和单个SNP SNaPshot基因分型的实验样品:[0066]1、重复精液质量检测，确诊为弱精子症；
[0067]2、性功能正常；排除具有隐睾症病史、睾丸炎、输精管梗阻、输精管切除术、多染色体异常及Y染色体无精子症因子微缺失等具有已知病因的患者；
[0068]3、与病例年龄匹配的健康男性对照。
[0069]并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
[0070]实施例2外周血DNA中SNP的全基因组扫描
[0071]在上述符合条件的236例临床原因不明的弱精子症患者和234例健康男性对照中，两组年龄匹配。将这两组人群经Illumina全测序获得相关结果。具体步骤为:
[0072]1、向储存于2ml冻存管中的血细胞加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下:蔗糖 219.72g、氯化镁 2.02g 和曲拉通 X-100 (amresco0694) 20ml 混合后，用 TrisHcl溶液定容至2000ml,下同),颠倒混匀后完全转入。
[0073]2、去除红细胞:用溶血试剂将5ml离心管补至4ml,颠倒混匀,4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂,再次颠倒混匀清洗一次,4000rpm离心10分钟,弃上清。
[0074]3、抽提DNA:向沉淀中加Iml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml 0.5M乙二胺四 乙酸，15ml 10%十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8 μ I蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37°C水浴过夜。
[0075]4、去除蛋白质:加Iml Tris-平衡酹充分混匀(手轻摇15分钟),4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿:异戊醇=24:1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
[0076]5、DNA沉淀:在上清液中加入3M的醋酸钠60 μ I,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心lOmin。
[0077]6、DNA洗漆:在沉淀中加入冰无水乙醇lml, 12000rpm离心IOmin,弃上清后真空
抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
[0078]7、测量浓度:通常能得到20-50ng/ μ I DNA,纯度(紫外2600D与2800D比值)在1.6_2.0 ο
[0079]8、进行全测序:利用Illumina测序技术进行线粒体全基因组扫描。
[0080]9、数据分析与处理:在“临床原因不明的弱精子症病例”组和“健康男性对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的遗传变异在上文中已经罗列出，结果见表1。
[0081]表1:病例组与对照组全基因组关联分析结果
【权利要求】
1.一种与临床原因不明的弱精子症辅助诊断相关的线粒体DNA的SNP标志物，其特征在于该标志物为 C5601T, T12338C, A12361G, G13928C, A15851G, C16179T, G16291A 的组合。
2.一种与临床原因不明的弱精子症辅助诊断相关的基因，其特征在于该基因的序列为登录号为NC_012920.1的线粒体DNA序列中存在下列SNP:C5601T, T12338C, A12361G, G13928C, A15851G, C16179T, G16291A。
3.用于检测权利要求1所述的SNP标志物的特异性扩增引物，其特征在于该扩增引物为: C5601T的引物序列为SEQ ID No:l和SEQ ID No:2 ;T12338C的引物序列为SEQ IDNo:4 和 SEQ ID No:5 ;T12361G 的引物序列为 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 ;G13928C 的引物序列为 SEQ ID No: 10 和 SEQ ID No: 11 ;A15851G 的引物序列为 SEQ ID No: 13 和 SEQ IDNo:14 ;C16179T 的引物序列为 SEQ ID No: 16 和 SEQ ID No: 17 ;G16291A 的引物序列为 SEQID No:19 和 SEQ ID No:20。
4.用于检测权利要求1所述的SNP标志物的特异性延伸引物，其特征在于该延伸引物为: C5601T的延伸引物序列为SEQ ID No:3 ;T12338C的延伸引物序列为SEQ ID No:6 ；A12361G的延伸引物序列为SEQ ID No:9 ;G13928C的延伸引物序列为SEQ ID No:12 ；A15851G的延伸引物序列为SEQ ID No: 15 ;C16179T的延伸引物序列为SEQ ID No: 18;G16291A的延伸引物序列为SEQ ID No:21。
5.权利要求1所述的SNP标志物在制备临床原因不明的弱精子症辅助诊断试剂盒中的应用。`
6.权利要求2所述的基因在制备临床原因不明的弱精子症辅助诊断试剂盒中的应用。
7.权利要求3所述的特异性扩增引物和/或权利要求4所述的特异性延伸引物在制备临床原因不明的弱精子症辅助诊断试剂盒中的应用。
8.一种临床原因不明的弱精子症辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血 DNA 中 C5601T, T12338C, A12361G, G13928C, A15851G, C16179T, G16291A。
9.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述的特异性扩增引物和/或权利要求3所述的特异性延伸引物。
10.根据权利要求8或9所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。
【文档编号】C12N15/11GK103773859SQ201410012282
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】陆春城, 王嵘, 夏彦恺, 吴炜, 许妙斐, 秦玉峰, 陈敏健, 杜桂珍, 王心如 申请人:南京医科大学