R的方法拼接，将合成好的检测祀标基因序列克隆 入P18-T载体PMD18-TvectoHTakara)中，构建分别包含乙型肝炎病毒A-H八种亚型 检测祀标基因标准序列的质粒，命名为：PMT-HBV-A，PMT-HBV-B，PMT-HBV-C，PMT-HBV-D， PMT-HBV-E，PMT-HBV-F，PMT-HBV-G，PMT-HBV-H。
[0018] 本发明的有益效果为：（1)本品采用聚合酶链式反应（PCR)结合巧光探针技术，检 测样品中A-H型乙型肝炎病毒分型，所设计的探针和引物特异性型及灵敏度高，准确性好。 (2)成本经济，操作方法快速简便，适宜广泛推广应用。
【具体实施方式】
[0019] 下面是上述针乙型肝炎病毒八种基因分型的PCR试剂盒及利用其进行定量检测 的方法的具体说明，但不W任何形式限制本发明。实施例中所使用的实验方法如无特殊说 明，均为常规方法。所用的材料、试剂、及所合成的引物和探针序列等，如无特殊说明，均可 从商业途径得到。
[0020] 实施例1:针乙型肝炎病毒八种基因分型的PCR试剂盒中引物、探针序列的设计及 合成 从GenBank(美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库）中捜索皿VA-H型基因型 的全序列并利用BLAST序列分析进行比对，筛出高度保守区域，针对保守序列采用引物设 计软件PrimerPremier5分别设计引物和对应的特异性探针，并检测是否有发夹结构或 者二聚体形成，结果表明设计的探针满足特异性要求，且不会形成发夹结构或者二聚体。所 设计的引物、探针序列分别为： ① 针对乙型肝炎病毒A型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 皿V-A-FACCTGGGTGGGTAATAATTTGGA 皿V-A-RGAAACCACAATAGTTGCCTGATCTT HBV-A-PAATTGACTACTAGATCCCTG ② 针对乙型肝炎病毒B型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-B-FCTCGTGGTGGACTTCTCTCAATT 皿V-B-RATCCAGCGATAACCAGGACAAAT皿V-B-PCAAATCTCCAGTCACTCAC ③ 针对乙型肝炎病毒C型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 皿V-C-FGAGCCAACTCAAACAATCCAGAT HBV-C-RGAATGCTCCCGCTCCTACCT HBV-C-PCCCCAACAAGGATC ④ 针对乙型肝炎病毒D型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 皿V-D-FGGGAACTTTACTGGGCTTTATTCTT 皿V-D-RGGGCCTACAAACTGTTCACATTT HBV-D-PCTCATTGGAAAACACC ⑥ 针对乙型肝炎病毒E型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-E-FAGTGAACCCTGTTCCGACTACTG HBV-E-RGGTCCCCAATCCTCGAGAA HBV-E-PCTCACTCATCTCGTCAAT ⑧ 针对乙型肝炎病毒F型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-F-FGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACC 皿V-F-RGTAATGATCCCCAACTGCCAAT 皿V-F-PATGGATACCCACAGATAA ⑦ 针对乙型肝炎病毒G型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 皿V-G-FTGGAAAGTCTGTCAACGAATAACTG 皿V-G-RAAGGCAGGGTAACCACATTGG HBV-G-PTTTCGCTGCTCCTTTT ⑨ 针对乙型肝炎病毒Η型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-H-FCCCGTGTGTCCTCTACTTCCA 皿V-H-RAAGAGTGGTGCAGGTTTTGCA皿V-H-PATCTACAACCACCAGCACG。
[0021] 上述的探针中，皿V-A-P的检测祀标基因位点位于乙型肝炎病毒A型基因型全 序列的2143-2162碱基，皿V-B-P的检测祀标基因位点位于乙型肝炎病毒B型基因型全 序列的320-338碱基，皿V-C-P的检测祀标基因位点位于乙型肝炎病毒C型基因型全序 列的2985-3998碱基，皿V-D-P的检测祀标基因位点位于乙型肝炎病毒D型基因型全序 列的2521-2536碱基，皿V-E-P的检测祀标基因位点位于乙型肝炎病毒E型基因型全序 列的106-123碱基，皿V-F-P的检测祀标基因位点位于乙型肝炎病毒F型基因型全序列 的931-814碱基，皿V-G-P的检测祀标基因位点位于乙型肝炎病毒G型基因型全序列的 1014-1029碱基，皿V-H-P的检测祀标基因位点位于乙型肝炎病毒Η型基因型全序列的 490-508碱基，其对应的标准品序列在基因库可查。
[0022] 具体对每种探针的巧光标记，遵循如下原则，根据仪器对巧光的分辨条件，选择巧 光报告基团和对应的巧光泽灭基团。为便于使用及提高反应的特异性、准确性，可将针对乙 型肝炎病毒A-D型基因型的PCR反应液体系组成第一反应体系，所述针对乙型肝炎病毒A-D 型基因型的PCR反应液体系组成第一反应体系，针对乙型肝炎病毒Ε-Η型基因型的PCR反 应液体系组成第二反应体系，该设计减少了反应样本，简化了操作，提高了实验效率。
[0023] 实施例2:利用上述试剂盒对阳性标准品进行检测 (1)根据基因库查询结果，委托专业公司巧日上海生工，英潍捷基(上海）贸易有限公 司）合成针对乙型肝炎病毒的八种基因亚型的标准序列、引物及探针序列，并作如下标记： 皿V-A-P的5'端标记FAM，3'端标记MGB，皿V-B-P的5'端标记肥X，3'端标记MGB，皿V-C-P 的5'端标记R0X，3'端标记MGB，皿V-D-P的5'端标记CY5, 3'端标记MGB，皿V-E-P的5' 端标记FAM，3'端标记MGB，皿V-F-P的5'端标记肥X，3'端标记MGB，皿V-G-P的5'端标记 R0X，3'端标记MGB，皿V-H-P的5'端标记CY5, 3'端标记MGB。
[0024] 采用市售的巧光PCR试剂或试剂盒或PremixExTaq试剂盒准备PCR反应体系。 分为第一反应体系和第二反应体系，第一反应体系中包括针对乙型肝炎病毒ABCD型基因 型的引物和探针(带有上述巧光标记)，第二反应体系中包括针对乙型肝炎病毒EFGH型基因 型的引物和探针，具体的，各PCR反应体系的工作液和反应条件如下： 1)第一反应体系：PCR扩增反应体系为20μレ其中包括10XPCRBuffer2μ^(1ΝΤΡ(2. 5mmoL/L) 2μL、Taq酶（5U/μL) 0. 07μL、皿V-A-F/R(5μΜ) 0. 3μL、皿V-A-P(5μΜ) 1. 5μΙ、HBV-B-F/R(5μΜ) 0. 3μΙ、HBV-B-P(5μΜ) 1. 5μΙ、HBV-C-F/R(5μΜ) 0. 3μΙ、 皿V-C-P(5μΜ) 1. 5μL、皿V-D-F/R(5μΜ) 0. 3μL、皿V-D-P(5μΜ) 1. 5μL、A-D标准序 列的DM各2μ1^、补d地2〇 0. 73μL至终体积为20μL。
[002引 2)第二反应体系：PCR扩增反应体系为20化，其中包括lOXPCRBuffer2化、dNTP(2. 5mmoL/L) 2μL、Taq酶（5U/μL) 0. 07μL、皿V-E-F/R(5μΜ) 0. 3μL、皿V-E-P (5μΜ) 1.5化、HBV-F-F/R(5μΜ)0. 3μΙ、HBV-F-P(5μΜ) 1. 5μΙ、HBV-G-F/R(5μΜ) 0. 3yL、皿V-G-P(5μΜ) 1.5yL、皿V-H-F/R(5μΜ)0. 3yL、皿ν-Η-Ρ(5μΜ) 1.5yL、A-D标准序列的DM各DM2μ1^、补d地20 0. 73μL至终体积为20μL; (4)将上述各20μΙ体系分别加入至PCR管中，盖上管盖，将PCR管放入巧光定量PCR检测仪中（ABI公司的AB口500检测仪等)，运行PCR反应，反应条件：95°C2min;再按 95°C15s，60°CImin，循环40次；反应体系为20yL。巧光通道检测选择：检测选用FAM、 肥X、R0X和CY5通道。
[002引（5)数据分析， 本发明提供的引物对乙型肝炎病毒八种基因分型都有很好的特异性扩增，利用标记的 巧光报告基团能得到准确、稳定、平行性好的结果。
[0027] 实施例3:利用上述试剂盒进行样本检测的方法 (1) 根据上述设计的引物及探针的序列，委托专业公司巧日上海生工，英潍捷基（上海） 贸易有限公司）合成引物及探针，并标记备用； (2) 提取待测血清样品并提取其乙型肝炎病毒DNA 抽取受检者静脉血1ml，注入无菌1. 5ml的离屯、管中，室溫静置化后，取上清转至另一 无菌离屯、管中，即为血清样本；借助DNA提取液按照常规方法提取乙型肝炎病毒DNA; (3) 准备PCR反应体系 本实施例中对乙型肝炎病毒的八种基因亚型同时进行分型检测，采用市售的普通PCR试剂或试剂盒或PremixExTaq试剂盒。其中针对乙型肝炎病毒的PCR反应体系分两个， 分别为第一反应体系和第二反应体系，第一反应体系中包括针对乙型肝炎病毒ABCD型基 因型的引物和探针，第二反应体系中包括针对乙型肝炎病毒EFGH型基因型的引物和探针； 所用的各反应体系中的探针都带有可被仪器区分的巧光报告基团和巧光泽灭基团，同时设 置没有乙肝病毒DNA的空白对照，和A-H阳性标准品的阳性对照PCR体系。具体的，各PCR 反应体系的工作液和反应条件如下： 1)第一反应体系：PCR扩增反应体系为20μレ其中包括10XPCRBuffer2μ^dNTP(2. 5mmoL/L) 2μL、Taq酶（5U/μL) 0. 07μL、皿V-A-F/R(5μΜ) 0. 3μL、皿V-A-P(5μΜ) 1. 5μΙ、HBV-B-F/R(5μΜ) 0. 3μΙ、HBV-B-P(5μΜ) 1. 5μΙ、HBV-C-F/R(5μΜ) 0. 3μΙ、 皿V-C-P