(5μΜ)1. 5yL、皿V-D-F/R(5μΜ)0. 3yL、皿V-D-P(5μΜ)1. 5yL、样本DNA2yL、 补(1地2〇 6. 73μL至终体积为20μL。
[002引 2)第二反应体系：PCR扩增反应体系为20化，其中包括lOXPCR Buffer2化、dNTP(2.5mmoL/L)2μ L、Taq酶（5U/ μ L)0.07 μ L、皿V-E-F/R (5 μΜ)0.3 μ L、皿V-E-P (5μΜ) 1.5化、HBV-F-F/R (5μΜ)0. 3μΙ、HBV-F-P (5μΜ) 1. 5μΙ、HBV-G-F/R (5μΜ) 0.3μL、皿V-G-P(5μM)1.5μL、皿V-H-F/R(5μM)0.3μL、皿V-H-P(5μM)1.5μL、样本 DNA2μ1^、补d地2〇6. 73 μ L至终体积为 20μ L ; 3)空白对照PCR体系I:PCR扩增反应体系为20μレ其中包括lOXPCR Buffer2μ^ dNTP(2.5mmoL/L)2μL、Taq酶（5U/μL)0.07μL、HBV-A-F/R (5 μΜ)0.3μL、HBV-A-P (5μΜ) 1.5化、HBV-B-F/R (5μΜ)0. 3μΙ、HBV-B-P (5μΜ) 1. 5μΙ、HBV-C-F/R (5μΜ) 0.3μL、皿V-C-P(5μM)1.5μL、皿V-D-F/R(5μM)0.3μL、皿V-D-P(5μM)1.5μL、蒸馈 水2μ1^、补(1地2〇6. 73μL至终体积为20μL ; 空白对照PCR体系II:PCR扩增反应体系为20μレ其中包括lOXPCR Buffer2μ^dNTP(2.5mmoL/L)2μL、Taq酶（5U/μL)0.07μL、皿V-E-F/R (5 μΜ)0.3μL、皿V-E-P (5μΜ) 1.5化、HBV-F-F/R (5μΜ)0. 3μΙ、HBV-F-P (5μΜ) 1. 5μΙ、HBV-G-F/R (5μΜ) 0.3μL、皿V-G-P(5μM)1.5μL、皿V-H-F/R(5μM)0.3μL、皿V-H-P(5μM)1.5μL、蒸馈 水2μ1^、补(1地2〇6. 73μL至终体积为20μL ; 4) 阳性对照PCR体系参见实施例2中的第一反应体系和第二反应体系； (4)将上述各20μL体系分别加入至PCR管中，盖上管盖，将PCR管放入巧光定量PCR检测仪中设日ΑΒΙ公司的ΑΒ口500检测仪等)，运行PCR反应，反应条件：95°C2min;再 按95°C15s，60°CImin，循环40次；巧光通道检测选择：检测选用FAM、肥X、R0X和CY5通 道。
[002引 （5)数据分析， 综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阔值和基线，空白对照组委隐形，各型阳性 对照组均为阳性，待测样本根据所属体系及检测到的巧光信号确认对应亚型是否有扩增， 从而得出为哪种亚型的乙型肝炎病毒感染或混合型感染。
【主权项】
1. 乙型肝炎病毒八种基因分型的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如 下_至⑧中的至少一个PCR反应液体系： ① 针对乙型肝炎病毒A型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-A-FACCTGGGTGGGTAATAATTTGGA HBV-A-RGAAACCACAATAGTTGCCTGATCTT HBV-A-PAATTGACTACTAGATCCCTG ② 针对乙型肝炎病毒B型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-B-FCTCGTGGTGGACTTCTCTCAATT HBV-B-RATCCAGCGATAACCAGGACAAAT HBV-B-PCAAATCTCCAGTCACTCAC ③ 针对乙型肝炎病毒C型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-C-FGAGCCAACTCAAACAATCCAGAT HBV-C-RGAATGCTCCCGCTCCTACCT HBV-C-PCCCCAACAAGGATC ④ 针对乙型肝炎病毒D型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-D-FGGGAACTTTACTGGGCTTTATTCTT HBV-D-RGGGCCTACAAACTGTTCACATTT HBV-D-PCTCATTGGAAAACACC ⑤ 针对乙型肝炎病毒E型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-E-FAGTGAACCCTGTTCCGACTACTG HBV-E-RGGTCCCCAATCCTCGAGAA HBV-E-PCTCACTCATCTCGTCAAT ⑥ 针对乙型肝炎病毒F型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-F-FGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACC HBV-F-RGTAATGATCCCCAACTGCCAAT HBV-F-PATGGATACCCACAGATAA ⑦ 针对乙型肝炎病毒G型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-G-FTGGAAAGTCTGTCAACGAATAACTG HBV-G-RAAGGCAGGGTAACCACATTGG HBV-G-PTTTCGCTGCTCCTTTT ⑧ 针对乙型肝炎病毒Η型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针 HBV-H-FCCCGTGTGTCCTCTACTTCCA HBV-H-RAAGAGTGGTGCAGGTTTTGCA HBV-H-PATCTACAACCACCAGCACG。2. 根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒八种基因分型的荧光PCR试剂盒，其特征在于， 所述每种探针一端标记有荧光报告基团FAM、TET、HEX、ROX、JOE、CY3、CY5、TAMRA或Texas Red，另一端标记有荧光淬灭基团MGB、BHQ-1、BHQ-2、LowaBlackRQ、LowaBlack?FQ或 Dabcyl〇3. 根据权利要求2所述的乙型肝炎病毒八种基因分型的荧光PCR试剂盒，其特征在于， 所述针对乙型肝炎病毒A-D型基因型的PCR反应液体系组成第一反应体系，其中HBV-A-P的5'端标记FAM，3'端标记MGB，HBV-B-P的5'端标记HEX，3'端标记MGB，HBV-C-P的5' 端标记ROX，3'端标记MGB，HBV-D-P的5'端标记CY5, 3'端标记MGB; 针对乙型肝炎病毒E-Η型基因型的PCR反应液体系组成第二反应体系，其中HBV-E-P的5'端标记FAM，3'端标记MGB，HBV-F-P的5'端标记HEX，3'端标记MGB，HBV-G-P的5' 端标记ROX，3'端标记MGB，HBV-H-P的5'端标记CY5, 3'端标记MGB。4. 根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒八种基因分型的荧光PCR试剂盒，其特征在于， 所述试剂盒中还包括乙型肝炎病毒A-Η型基因型的标准序列。5. 乙型肝炎病毒八种基因分型的非诊断性检测方法，其特征在于，所述方法包括以下 步骤： (1) 合成权利要求1所述的引物和探针； (2) 根据仪器对各探针两端分别标记权利要求2中所述的荧光报告基团和相应的荧光 淬灭基团； (3)制备阳性标准品； (4) 提取待测样品DNA; (5) 准备PCR反应体系； (6) 运行PCR; (7) 数据分析。6. 根据权利要求5所述的乙型肝炎病毒八种基因分型的非诊断性检测方法，其特征在 于，所述步骤（3)中阳性标准品的制备方法为构建分别包含乙型肝炎病毒A-Η八种基因亚 型检测靶标基因标准序列的质粒：分别合成乙型肝炎病毒A-Η八种基因亚型检测靶标基因 标准序列并克隆入P18-T载体中，命名为PMT-HBV-A，PMT-HBV-B，PMT-HBV-C，PMT-HBV-D， PMT-HBV-E，PMT-HBV-F，PMT-HBV-G，PMT-HBV-Ho7. 根据权利要求5所述的乙型肝炎病毒八种基因分型的非诊断性检测方法，其特征在 于，所述步骤（2)中探针的标记分别为：HBV-A-P的5'端标记FAM，3'端标记MGB，HBV-B-P 的5'端标记HEX，3'端标记MGB，HBV-C-P的5'端标记R0X，3'端标记MGB，HBV-D-P的5' 端标记CY5, 3'端标记MGB;HBV-E-P的5'端标记FAM，3'端标记MGB，HBV-F-P的5'端标记 HEX，3'端标记MGB，HBV-G-P的5'端标记R0X，3'端标记MGB，HBV-H-P的5'端标记CY5， 3立而标记MGB; 步骤（5)中PCR反应体系分成两个，针对乙型肝炎病毒AB⑶型基因型的引物和探针加 入至第一反应体系，针对乙型肝炎病毒EFGH型基因型的引物和探针加入至第二反应体系。8. 根据权利要求7所述的乙型肝炎病毒八种基因分型的非诊断性检测方法，其特征在 于，所述步骤（6)运行PCR时荧光通道检测选择：检测选用FAM、HEX、R0X和CY5通道。9. 根据权利要求5所述的乙型肝炎病毒八种基因分型的非诊断性检测方法，其特征在 于，所述步骤（6)运行PCR是的反应程序为95°C2min;再按95°C15s，60°Clmin，循环40 次。
【专利摘要】本发明提供一种乙型肝炎病毒八种基因分型的荧光PCR试剂盒及检测方法，属于生物检验技术领域。采用的技术方案是：设计合成特异性针对乙型肝炎病毒八种基因亚型的引物和探针，并分别对探针进行荧光标记，运用荧光PCR方法进行特异性检测。本发明的有益效果为：（1）本品采用聚合酶链式反应(PCR)结合荧光探针技术，检测样品中A-H型乙型肝炎病毒分型，所设计的探针和引物特异性型及灵敏度高，准确性好。（2）成本经济，操作方法快速简便，适宜广泛推广应用。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN105256075
【申请号】CN201510804784
【发明人】李云, 张明, 史玲莉, 曹彦强, 闫冀焕, 沈军, 李薇, 兰景, 付晓昀, 林玉楼
【申请人】河北国际旅行卫生保健中心
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月20日