基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测试剂、PCR检测方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学生物核酸检测技术领域，具体涉及一种基于肽核酸探针的 fct信号通路中Pyg〇2基因突变的检测试剂、PCR检测方法及应用。
【背景技术】
[0002] fct信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高 度保守的信号通路。fct信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过 程中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达，导 致信号异常活化，就可能诱导癌症的发生。Wnt信号通路包括经典的Wnt信号通路与非经 典的fct信号通路，在经典通路即Wnt-β -catenin信号通路中，Wnt因子通过激活细胞膜 上的Frizzle/LRP5/6协同受体后抑制细胞内游离β -catenin蛋白的磷酸化和降解，细 胞质中的β-catenin蛋白水平升高后将发生β-catenin蛋白的核移位，导致细胞核中 β -catenin蛋白升高，胞核中β -catenin蛋白能够联合Pygo2、Bcl-9以及FoxMl蛋白共 同与TCF/LEF-1转录因子家族形成复合体并激活Wnt信号通路下游靶基因的转录激活。
[0003] Pygo2蛋白是Wnt信号通路中β-catenin下游重要成员之一，目前越来越多的研 宄已经发现，在很多肿瘤中Pyg〇2蛋白均呈现高表达。
[0004] 目前研宄核心信号通路的核心分子调控机制，以及某些重要成员在细胞中的表达 水平，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段，虽然近年来fct信号通路在癌症中的研宄，以及 Pyg〇2蛋白作为Wnt信号通路重要成员其表达水平的研宄，已经成为研宄开发肿瘤药物急 需解决的重要问题，但是同时其在很多肿瘤细胞中基因的突变也越来越多，尤其是在Pyg〇2 蛋白NHD端及PHD端发生的突变，对Pyg 〇2蛋白发挥功能启动非常重要的作用，例如在膀胱 癌细胞中检测出NHD端R46S突变，胰腺癌细胞中检测出P98H突变，肺腺癌细胞中检测出的 PHD端R334Q突变以及急性骨髓性白血病中检测出的R356P突变。
[0005] 肽核酸（peptide nucleic acids，PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA 类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成 的第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键 取代了 DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱 基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷， 与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或 DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA 分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识 别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种能确定Wnt信号通路中核心的信号 分子Pyg〇2基因突变情况，能解释核心分子Pyg〇2在肿瘤细胞中变化，结果重复性，敏感性 好的基于肽核酸探针的fct信号通路中Pyg〇2基因突变的检测试剂、PCR检测方法及应用。
[0007] 本发明目的的实现方式为，基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pyg〇2基因突变的 检测试剂，包括引物和探针，所述引物包括正向引物和反向引物，所述探针为肽核酸探针， 其特征在于：
[0008] 所述检测Pygo2基因 R46S突变正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1 ;
[0009] 所述检测Pygo2基因 R46S突变反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2 ;
[0010] 所述检测Pyg〇2基因 P98H突变正向引物如序列表中SEQ ID NO. 3 ;
[0011] 所述检测Pyg〇2基因 P98H突变反向引物如序列表中SEQ ID NO. 4 ;
[0012] 所述检测Pygo2基因 R334Q突变正向引物如序列表中SEQ ID NO. 5 ;
[0013] 所述检测Pygo2基因 R334Q突变反向引物如序列表中SEQ ID NO. 6 ;
[0014] 所述检测Pygo2基因 R356P突变正向引物如序列表中SEQ ID NO. 7 ;
[0015] 所述检测Pygo2基因 R356P突变反向引物如序列表中SEQ ID NO. 8 ;
[0016] 所述检测Pygo2基因 R46S突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 9 ;
[0017] 所述检测Pygo2基因 P98H突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 10 ;
[0018] 所述检测Pygo2基因 R334Q突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 11 ;
[0019] 所述检测Pygo2基因 R356P突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 12 ;
[0020] 所述肽核酸荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰 所述5'端的荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,修饰所述3'端的 淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL0
[0021] 基于肽核酸探针的fct信号通路中Pyg〇2基因突变的检测试剂进行检测的方法， 检测方法为基于肽核酸为荧光探针的实时荧光定量PCR方法；
[0022] 所述实时荧光定量PCR的反应体系为：正向引物、反向引物、DEPC水、具有5' 一3' 外切活性的 DNA 聚合酶、dNTPs、10XPCR Buffer、RNASIN、M-MLV 逆转录酶、oligo(dT)和含 Mg离子的溶液；
[0023] 所述具有5' 一 3'外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。
[0024] 基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pyg〇2基因突变的检测试剂的应用，用于制备 检测肿瘤细胞及正常细胞的检测试剂，所述癌细胞为膀胱癌细胞、胰腺癌细胞、肺腺癌细胞 或急性骨髓性白血病血细胞。
[0025] 本发明采用特异序列的PNA寡聚物作为探针。由于PNA是一种人工合成的核酸的 类似物，并且为非手性、不带电荷的分子，避免了寡核苷酸与其靶基因结合时因电荷相互排 斥所导致的杂交不稳定性，结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出极强的杂交优 势，大大提高了检测灵敏度。
[0026] 与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：Pyg〇2基因是新发现的Wnt信号通 路中β-catenin蛋白下游的发挥着重要功能的基因，借助本发明提供的检测试剂能够通 过实时荧光定量PCR法在转录水平快速检测出Pyg 〇2基因的突变，而与普通实时荧光定量 PCR不同的是，本申请人使用的肽核酸PNA荧光探针更加灵敏，本发明为抗癌药物的筛选， 新靶向药物的机制研宄都提供了非常有力的工具。
【附图说明】
[0027] 图1是本发明实施例中所述肽核酸质谱图；
[0028] 图2是本发明实施例中所述R46S突变型和野生型参考品PCR扩增图；
[0029] 图3是本发明实施例中所述P98H突变型和野生型参考品PCR扩增图；
[0030] 图4是本发明实施例中所述R334Q突变型和野生型参考品PCR扩增图；
[0031] 图5是本发明实施例中所述R356P突变型和野生型参考品PCR扩增图。
【具体实施方式】
[0032] 基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pyg〇2基因突变的检测试剂，所述引物包括正 向引物和反向引物，所述探针为肽核酸探针，其特征在于：
[0033] 所述检测Pygo2基因 R46S突变正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1 ;
[0034] 所述检测Pygo2基因 R46S突变反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2 ;
[0035] 所述检测Pygo2基因 P98H突变正向引物如序列表中SEQ ID NO. 3 ;
[0036] 所述检测Pygo2基因 P98H突变反向引物如序列表中SEQ ID NO. 4 ;
[0037] 所述检测Pygo2基因 R334Q突变正向引物如序列表中SEQ ID NO. 5 ;
[0038] 所述检测Pygo2基因 R334Q突变反向引物如序列表中SEQ ID NO. 6 ;
[0039] 所述检测Pygo2基因 R356P突变正向引物如序列表中SEQ ID NO. 7 ;
[0040] 所述检测Pygo2基因 R356P突变反向引物如序列表中SEQ ID NO. 8 ;
[0041] 所述检测Pygo2基因 R46S突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 9 ;
[0042] 所述检测Pygo2基因 P98H突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 10 ;
[0043] 所述检测Pygo2基因 R334Q突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 11 ;
[0044] 所述检测Pygo2基因 R356P突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 12。
[0045] 所述肽核酸荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰 所述5'端的荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,修饰所述3'端的 淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL0
[0046] 检测试剂还含有对比试剂，对比试剂为与Pyg〇2基因野生型互补的肽核酸序列，
[0047] 所述特异性结合包含Pygo2基因46密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO. 13 ；
[0048] 所述特异性结合包含Pygo2基因98密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO. 14 ；
[0049] 所述特异性结合包含Pygo2基因334密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO. 15 ；
[0050] 所述特异性结合包含Pygo2基因356密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO. 16 〇
[0051] 本发明所用肽核酸的质谱图见图1。
[0052] 用基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pyg〇2基因突变的检测试剂进行检测的方 法，检测方法为PCR检测方法，所述PCR检测方法为基于肽核酸为荧光探针的实时荧光定量 PCR方法；
[0053] 所述实时荧光定量PCR