的反应体系为：正向引物、反向引物、DEPC水、具有5' 一3' 外切活性的 DNA 聚合酶、dNTPs、10XPCR Buffer、RNASIN、M-MLV 逆转录酶、oligo(dT)和含 Mg离子的溶液；
[0054] 所述具有5' 一 3'外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。
[0055] 基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pyg〇2基因突变的检测方法，检测的步骤如 下：
[0056] 1)针对Pygo2基因46、98、334、356密码子突变型设计检测这些位点的引物及？嫩 探针；
[0057] 2)针对Pygo2基因46、98、334、356密码子序列设计与这些位点野生型互补的4段 PNA序列；
[0058] 3)构建含有Pyg〇2基因突变型和野生型的质粒，并计算拷贝数，制成参考品；
[0059] 4)提取待测细胞中mRNA ;
[0060] 5)用上述检测Pyg〇2基因突变试剂对参考品和样本进行荧光定量PCR检测，并判 断Pygo2基因46、98、334、356密码子是否发生突变。
[0061] 所述PCR反应液中所述Taq酶的终浓度为0· OlU/ μ L~0· 05U/ μ L，所述dNTPs 的终浓度为0. 2~0. 6mM，所述10 X PCR Buffer的终浓度为I X，所述RNASIN的终浓度为 40U/ μ L~60U/ μ L，所述M-MLV逆转录酶的终浓度为200U/ μ L~320U/ μ L，所述MgCl^ 终浓度为1. 5~5. OmM，溶剂为DEPC水，所述正向引物的终浓度为0. 05~0. 9 μ Μ，所述反 向引物的终浓度为0. 05~0. 9 μ Μ，所述荧光探针的终浓度为0. 05~0. 9 μ Μ。
[0062] 所述实时荧光定量PCR的反应程序为：42°C逆转录20min ;94°C预变性，2min ; 95°C变性，30s ;58°C，45s ;进行40个循环。
[0063] 本发明的实验体系可以在任何一台实时荧光定量PCR仪器上进行，其PCR反应仪 器为Applied Biosystems公司7500型焚光定量PCR仪。上述引物置于八联管中，进行实 时荧光定量PCR检测，实验操作简单，费用低廉，结果重复性，敏感性好，是研宄肿瘤相关药 物作用机理及基础科学研宄的一种重要手段。
[0064] 基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pyg〇2基因突变的检测试剂用于制备检测肿瘤 细胞及正常细胞的检测试剂，所述癌细胞为膀胱癌细胞、胰腺癌细胞、肺腺癌细胞或急性骨 髓性白血病血细胞。
[0065] 本发明通过胰腺癌细胞进行举例说明。
[0066] 本发明中PNAC-I (人胰腺癌PNAC-I细胞系）细胞系购自美国ATCC，培养细胞所 使用的RPMI-1640培养基及10%胎牛血清均购自英俊公司，其他试剂主要购自宝生物工程 (大连）有限公司。
[0067] 利用本发明所述试剂检测细胞内Wnt信号通路Pyg〇2基因突变包括以下具体步 骤：
[0068] -、引物探针设计
[0069] 根据美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)报道的 hPygo2mRNA 序列（NCBI Reference Sequence:NM_138300.3)，使用 Applied Biosystems 公司开发的 Primer Express Software for Real-Time PCR软件设计特异的Pygo2引物与探针。
[0070] Pygo2R46S ：
[0071] Pygo2_F:5'-CAGGGCAAGGCCGGTCT-3' ；
[0072] Pygo2_R:5'-ACTCCGTCAGATGTGAGTATGCAG-3' ；
[0073] Pyg〇2(PNA)-P:5'FAM-AGCGAAGCAAGTCAAATACTC-BHQ 3' ；
[0074] Pygo2-PNA ：AGCGAAGGAAGTCAAATACTC
[0075] 靶序列：
[0076] AAGCAGGGCAAGGCCGGTCTGCAAATGAAGAGTCCAGAAAAGAAGCGAAGGAAGTCAAATACTCAGGGC CCTGCATACTCACATCTGACGGAGTTT
[0077] Pygo2P98H:
[0078] Pygo2_F:5'-TTGAAGATGACTTCGGAGCC-3' ；
[0079] Pygo2_R:5'-CACCTCCAGTGCTGTAGCCTG-3' ；
[0080] Pygo2(PNA)-P:5'FAM-CTTGGCAGTCATGTGCCCTT-BHQ 3' ；
[0081] Pygo2-PNA ：CTTGGCAGTCCTGTGCCCTT
[0082] 靶序列：
[0083] CCCTTTTGAAGATGACTTCGGAGCCCCCAAAGTGGGGGTTGCAGCCCCTCCATTCCTTGGCAGTCCTGT GCCCTTCGGAGGCTTCCGTGTGCAGGGGGGCATGGCGGGCCAGGTACCCCCAGGCTACAGCACTGGAGGTGGAGGG
[0084] Pygo2R334P ：
[0085] Pygo2-F:5'-CCGGCTGCTGCTGTTAATG-3' ；
[0086] Pygo2-R:5,-GGAGGCCTCACACAGAATGG-3，；
[0087] Pygo2(PNA)-P:5'FAM-GGTGCCTGTCAGAGTGAGGT-BHQ 3' ；
[0088] Pygo2-PNA ：GGTGCCTGTCGGAGTGAGGT
[0089] 靶序列：
[0090] GCTCCCCGGCTGCTGCTGTTAATGGGAACCAGCCCAGTTTCCCCCCGAACAGCAGTGGGCGGGGTGGGG GCACTCCAGATGCCAACAGCTTGGCACCCCCTGGCAAGGCAGGTGGGGGCTCCGGGCCCCAGCCTCCCCCAGGCTTG GTGTACCCATGTGGTGCCTGTCGGAGTGAGGTGAACGATGACCAGGATGCCATTCTGTGTGAGGCCTCCTGC
[0091] Pygo2R356P:
[0092] Pygo2-F:5'-CCATTCTGTGTGAGGCCTCC-3' ；
[0093] Pygo2-R:5'-CACGGATGTAGACAGACTGGATCT-3' ；
[0094] Pygo2(PNA)-P:5'FAM-CACCCTGAGTGCACAGGCA-BHQ 3' ；
[0095] Pygo2-PNA ：CACCGTGAGTGCACAGGCA
[0096] 靶序列：
[0097] GGATGCCATTCTGTGTGAGGCCTCCTGCCAGAAATGGTTCCACCGTGAGTGCACAGGCATGACTGAG AGCGCCTATGGGCTGCTGACCACTGAAGCTTCTGCCGTCTGGGCCTGCGATCTCTGCCTCAAGACCAAGGAGATC CAGTCTGTCTACATCCGTGAGGGCATGGGG
[0098] 以上：F :forward，正向；HW-F表示用于检测钩虫核酸的正向引物。
[0099] R :reverse，反向；HW-R表示用于检测钩虫核酸的反向引物。
[0100] P :probe，荧光探针；HW-P表示用于检测钩虫核酸的荧光探针，该荧光探针为 TaqMan荧光探针。
[0101] 在本发明实施例中，修饰荧光探针的5'端的荧光报告基团可以为：FAM，HEX，TET， JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5 ;修饰荧光探针的3'端的淬灭基团可以为：TAMRA，Eclipse，BHQl， BHQ2, BHQ3或DABCYL，该荧光报告基团与淬灭基团不影响荧光定量PCR的扩增，只需根据探 针的荧光报告基团和淬灭基团选择所用的仪器的型号设置可检测的荧光信号范围。本发明 实施例提供的荧光探针荧光报告基团：FAM、HEX、TET和FAM的激发波长为470-650nm，接收 波长为500-700nm ;淬灭基团：Eclipse、TAMRA、BHQl。引物合成后的纯化方式可以为：HAP、 PAGE和HPLC纯化方式。
[0102] 二、人胰腺癌PNAC-I细胞系培养与传代
[0103] 1)细胞培养
[0104]所有细胞系使用 RPMI-1640 培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA)，10%胎牛血清 (Invitrogen, Carlsbad, CA)，于 37°C、5% C02 环境下培养。
[0105] 2)细胞传代
[0106] 首先使用灭菌吸管将细胞培养皿中的培养液吸出，加入PBS缓冲液清洗2遍，往 细胞中慢慢滴加适量胰蛋白酶，待细胞变圆，调整角度细胞能够移动后加入3ml的含10% 胎牛血清的DMEM培养基，反复轻轻吹打后，显微镜下观察细胞形态并计数，根据培养皿中 细胞的含量将适量的细胞传代至其他灭菌的培养皿中，加入5ml的DMEM培养基后放入5% C02培养箱。
[0107] 细胞计数公式（个/ml) : (4大格细胞总数）X IO4X稀释倍数/4
[0108] 三、总RNA的提取
[0109] 1)倒掉培养基，PBS清洗后，直接将Iml Trizol注入培养瓶（其中细胞5 X IO6个 /ml)，反复抽吸均匀；
[0110] 2)在装有裂解物的离心管中加入0. 2ml的氯仿（为Trizol总体积的1/5)，振荡 混均30秒，室温下静置5分钟；
[0111] 3) 12000rpm 4°C离心15分钟，分相为三层。上层：RNA(约为Trizol的60% );中 间：DNA ;下层：蛋白质（酷-氯仿）；
[0112] 4)小心吸取上清液，转移到另一 EP管中。Iml裂解物产生的上清液体积约为 0. 4~0. 6ml。有机相和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及；
[0113] 5)上清液加入约0. 5ml的异丙醇，振荡混均30秒。室温下静置10分钟；
[0114] 6) 12000rpm 4°C 离心 10 分钟；
[0115] 7) RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液，注意避免吸弃RNA沉淀；
[0116] 8)离心管加入1ml预冷的75%乙醇（1ml Trizol至少Iml乙醇清洗DNA)，振荡混 均