, Λ CT值为2. 81 ±0. 29,表明20个单细胞的重复性好，一 致性尚。
[0134] 表 5 cDNA 扩增前 Real-time PCR CT 值
[0137] ②cDNA扩增复制的检测结果
[0138] 采用多次退火环状循环扩增技术对cDNA进行扩增复制，然后进行电泳检测。检测 结果如图8所示。结果显示扩增复制后的cDNA条带亮度明显高于相同体积的扩增前cDNA， 表明本发明采用的扩增复制方法能够有效提高cDNA量。
[0139] 将上述扩增复制后的cDNA进行稀释10倍、100倍、1000倍，然后进行实时定量PCR 扩增BKa基因。图9为平滑肌细胞cDNA扩增复制前后BKa基因 PCR荧光曲线图，各细 胞CT值如表6所示。结果显示，cDNA扩增复制后CT值明显降低，将扩增复制的cDNA稀释 1000倍后CT值仍低于未扩增复制的cDNA，由此表明，本方法扩增复制后的cDNA浓度至少 是扩增前的1000倍。
[0140] 表6 cDNA扩增复制后PCR扩增BK a基因的CT值
[0141]
[0142] 注：A组为扩增复制后的cDNA ;B组为A组cDNA稀释10倍；C组为A组cDNA稀释 100倍；D组为A组cDNA稀释1000倍；E组为未经过扩增复制的cDNA。
[0143] 综上，本发明的检测方法有效的增加了 cDNA量，可满足更多个基因的同步检测， 有效克服了单细胞的cDNA不适用于多基因同时检测及低拷贝基因检测的缺陷。
[0144] 试验例I
[0145] 本实验例同时采用冻融法、Trizol法和Triton X-IOO法裂解细胞，其他步骤同实 施例1和实施例2,裂解后的细胞继续进行后续试验。
[0146] (1)实验方法
[0147] 冻融法裂解细胞：将装有单个细胞的PCR管置于液氮中冷冻2min，取出后转移至 25°C水中放置2min，重复3次，4°C下12000rpm转速离心lmin。
[0148] Trizol法裂解细胞：在装有单个细胞的PCR管中分别加入1 μ 1的Trizol，室温静 止5min ;加入0· 5 μ 1的Trizol，室温静止5min ;加入0· 5 μ I Trizol后再冻融。
[0149] Triton Χ-100法裂解细胞：在装有单个细胞的PCR管中分别加入ΙμL Triton X-100,室温静止 5min;加入0·5μ1 Triton X-100,室温静止 5min;加入0·5μ1 Triton X-IOO后再冻融。
[0150] (2)实验结果
[0151] 本对比例同时采用trizol法、triton X-100法和冻融法裂解肠系膜动脉平滑肌 细胞，裂解后的细胞经反转录后，扩增BKa基因片段，结果如图10和图11所示，表明用 0· 5 μ I TrizolU μ I Trizol 以及加入 0· 5 μ I Trizol 或 1 μ I Trizol 后再进行冻融的细 胞都没有扩增得到BKa基因片段。
[0152] (3)实验讨论
[0153] Trizol含有苯酷、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞溶解蛋白质并使蛋白质 二级结构消失，是一类强力的细胞破碎及蛋白质变性剂。Trizol处理后的细胞直接进行 RT-PCR反应，同样可迅速破坏反应体系中反转录酶及DNA聚合酶的结构及活性，使反转录 及PCR反应无法进行。
[0154] 用0· 5 μ I triton X-100及1 μ I triton X-100裂解的细胞以及冻融法裂解的细 胞都能够检测到BKa基因片段的表达，其中triton X-100处理组BKa扩增产物总量明显 低于冻融法处理组，同时CT值明显高于冻融法处理组。由此表明，triton X-100处理后的 细胞PCR效率被明显抑制。
[0155] 与其他处理因素相比，冻融法处理后的细胞实时定量PCR CT值最小，扩增产物 DNA条带最亮。表明冻融法处理后的细胞PCR扩增效率较高。冻融法是利用热胀冷缩的原 理使细胞膜胀破，DNA、RNA从细胞中释放出来，再加入DNase I处理使DNA降解，全过程在 无 RNase的环境中完成，保证了 RNA不会被降解。冻融法未添加离子去垢剂、变性剂等影响 DNA聚合酶活性的成分，PCR扩增效率不受影响，冻融法处理后细胞的PCR扩增效率最高。 因此，本发明中所述的冻融法是最为安全、有效、简便、快速的单细胞裂解方法。
[0156] 实验例2
[0157] 本实验例为单细胞PCR扩增效率检测实验例。
[0158] (1)实验方法
[0159] 使用8个肠系膜血管平滑肌单细胞进行实验，前续步骤与实施例1相同（即cDNA 扩增复制之前的步骤均与实施例1相同），每个单细胞均合成得到的cDNA体积为20 μ 1，取 2 μ I cDNA配制PCR反应体系，则PCR体系中含有1/10个细胞的cDNA。
[0160] PCR反应体系包括：cDNA 2μ1 ;Ex Taq 聚合酶（5υ/μ1)0·25μ1 ;10XEx Taq Buffer (Mg2+Plus) 5 μ I ;dNTP Mixture (各 2. 5mM) 4 μ I ;上游引物 BK a F I μ 1，下游引物 BK a R 1 μ I ;去离子水36. 75,总体积50 μ 1。同时，将反转录合成的cDNA进行IOn倍数稀 释，分别取不同倍数稀释后的cDNA 2 μ 1配制PCR反应体系，此时PCR体系中含有10-(η+1) 个细胞的 cDNA。PCR 反应体系包括：cDNA 2μ1;Εχ Taq 聚合酶（5υ/μ1)0·25μ1;10ΧΕχ Taq Buffer (Mg2+Plus)5yl;dNTP Mixture(各2·5πιΜ)4μ1;上游引物 BKaF 1 μL，下游引 物BK a R 1 μ 1 ;去离子水36. 75,总体积50 μ 1。具体的cDNA稀释倍数、相对应的细胞数量 及细胞编号如表7所示。
[0161] 表7 cDNA模板稀释倍数及相应的细胞数量
[0162]
[0163] (2)实验结果
[0164] 以1、10、100、1000倍稀释cDNA，用不同倍数稀释的cDNA为模板PCR扩增BKa基 因。结果如图12所示，随着稀释倍数的增加，扩增的BKaDNA数量逐渐减少，cDNA模板稀 释1000倍后仍然能扩增到BK a基因片段。
[0165] (3)实验讨论
[0166] 单个细胞mRNA含量极低，这是单细胞RT-PCR区别于常规组织样品RT-PCR的明显 特征，更是单细胞RT-PCR的关键问题及技术难点。本发明将单个细胞反转录的cDNA以IO n 倍数逐级稀释，当稀释至1000倍，即PCR体系中含有1/10000个细胞的cDNA时，PCR反应 仍然可以扩增到目的基因。由此表明，本发明所述对cDNA进行全部复制的方法完全能够克 服单细胞RNA含量极低的缺陷，具有极高的灵敏度及精确度，完全适用于单个细胞甚至更 少cDNA模板的PCR扩增实验。
[0167] 对比例1负压抽吸法捕获单细胞
[0168] (1)细胞的分离
[0169] 细胞的分离方法同实施例1中步骤（1)。
[0170] (2)电极准备
[0171] 拉制电极的毛细玻璃管（如：Hematocrit Tubes，Drummond，U. S. A.)长度为 75_， 先经过180°C干烤6h后再用于拉制电极，任意拉制机都可以用于电极拉制。为了能够将 完整的单个细胞吸入，电极尖端口径略大于细胞直径，约10~15 μ m。本实验使用日本 PC-10(NARISHIGE公司）垂直微管电极拉制仪。电极经两步拉制，经过一次粗拉使玻璃管中 间拉成一窄细状，第二次拉制使窄细部位断开。首先设定电极两步拉制参数：第一步为电 流59mA，第二步电流为54mA ;然后将制备电极的毛细玻璃管固定于PC-10垂直微管电极拉 制仪上。经过两步拉制后将电极尖端进行打磨，使打磨后的电极尖端直径约为10 μπι，充灌 电极液后电极阻抗为500-600ΚΩ。
[0172] (3)细胞收集
[0173] 电极略加正压后放入细胞浴液中，入水前不冲灌电极液。借助倒置相差显微镜，利 用微推进器，控制微管电极靠近细胞，电极应顺着细胞的纵长方向接触细胞，施加负压将细 胞吸入电极后立刻停止负压。迅速利用推进器的粗调将电极提出液面。将电极深入到无 RNA酶的PCR管底，给电极内施以正压，将细胞及液体全部注入管内，最后在PCR管侧壁折断 电极前端，以保证取到的细胞被置入管中，迅速冷冻。
[0174] (4)实验结果
[0175] 用上述负压抽吸法捕获了 10个单细胞，其中有8个细胞在负压吸取时，细胞浴液 充满了整个玻璃微管电极。用玻璃微管电极捕获单个细胞的方法是借助于细胞膜片钳系统 完成的，因此，单细胞的捕获必须在不损坏膜片钳系统的基础上完成。
[0176] 在细胞膜片钳实验中，电极夹持器是连接探头与玻璃微管电极的桥梁，它必须具 备机械稳定性与低噪声的特点，才能保证良好的封接并记录到低噪声的离子通道电流。电 极夹持器多由于电极内液体从电极尾端漏出或被负压吸出而被污染，从而导致噪声增大， 影响正常的离子通道电流记录。
[0177] 根据细胞膜片钳技术操作规则，在灌注电极内液时，一定要尽量保持玻璃微管电 极尾端不能沾有电极内液，如沾有电极内液，一定要清理干净后再将电极插入电极夹持器 中；另外，当电极尖端过大或折断时，不要给予负压吸引，防止电极内液被吸入夹持器，导致 噪声增大，影响离子通道电流记录。
[0178]