茎瘤芥抗逆基因BjEFh1及其植物表达载体及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了茎瘤芥来源的抗逆基因BjEFh1及其植物表达载体及应用。本发明抗逆基因BjEFh1，其碱基序列如SEQ ID NO.1；本发明所构建的重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjEFh1是由SEQ ID NO.1序列连入植物表达载体pCAMBIA1302构成；所述植物表达载体用于植物遗传转化，BjEFh1基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达，大量合成BjEFh1蛋白，从而提高植物耐逆境能力。
【专利说明】茎瘤芥抗逆基因BjEFhl及其植物表达载体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及茎瘤芥来源的抗逆基因BjEFhl及其植物表 达载体及应用。
【背景技术】
[0002] 高盐、干旱和低温等非生物胁迫对作物的产量及生长发育有很大影响，因此，有关 植物抗逆性的研究一直是植物学研究领域的热点之一。
[0003] 莖瘤芥（Brassicajunceavar.tumidaTsenetLee)，又称青菜头，是十字花科 芸薹属植物，为榨菜的主要原料，是我国重庆、四川、浙江等地区主要的经济作物之一。多年 来，茎瘤芥的相关研究主要集中在遗传育种、良种繁育、栽培技术、品质安全等领域，近年才 陆续有生物学方面研究的报道，包括基因的克隆、功能研究以及茎瘤芥瘤状茎膨大相关研 究，企图通过基因工程方法提高茎瘤芥的产量、质量以及抗病性、抗逆性等。
[0004] 钙离子信号在许多细胞活动，如细胞代谢、基因表达、细胞骨架动态变化、细胞周 期、细胞死亡、信号传导等过程中有重要作用。
[0005] 在植物细胞中，钙离子的作用之一是作为第二信使，很多外界环境信号，如光、生 物胁迫、非生物胁迫、植物激素等都会刺激胞液中Ca2+浓度的增加，从而引发钙离子信号传 导。钙离子信号传导途径中首先响应的即是能结合Ca2+的钙结合蛋白，其结合Ca2+以后会 发生构想变化，使疏水面外露，从而激活或抑制其它蛋白的活性，从而引发信号传导。具报 道，钙结合蛋白包括钙调素、类钙调蛋白、钙依赖蛋白激酶等，其中对钙调素功能研究的报 道最多；但对类钙调蛋白、钙依赖蛋白激酶的功能研究较少，其分子机理研究更少报道。
[0006] 本发明克隆了一个茎瘤芥基因BjEFhl，由于其含有1对EF-hand(简称EFh)结构 域，而EFh结构域通常是可能结合钙离子的结构基序，目前报道的钙结合蛋白中，通常具有 1-3对EFh结构域，因此推测本发明克隆的茎瘤芥抗逆基因BjEFhl为钙结合蛋白家族基因。
【发明内容】
[0007] 鉴于此，本发明的目的之一是提供茎瘤芥抗逆基因BjEFhl，该基因全长821bp，其 核苷酸序列如SEQIDN0. 2所示；通过NCBI的0RF工具检测知其最大开放阅读框570bp， 如SEQIDNO. 1所示；因此，其5'端非编码区有88bp，3'端非编码区有163bp。
[0008] 本发明的目的之二是提供茎瘤芥抗逆基因蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO. 3所 示，有189个氨基酸，且序列通过NCBI的保守结构域（conserveddomains)检测知具有1 对EF-hand结构域。
[0009] 本发明的目的之三是提供茎瘤芥抗逆基因BjEFhl的重组植物表达载体 pCAMBIA1302-BjEFhl，其由SEQIDNO. 1序列连入植物表达载体pCAMBIA1302构成。
[0010] 本发明的目的之四是提供茎瘤芥抗逆基因BjEFhl在提高植物耐逆境特性中的应 用，尤其是提高植物在高盐条件的耐受力。
[0011] 本发明通过茎瘤芥转录组测序获得序列片段SEQIDN0. 4,然后根据片段SEQID NO. 4设计巢式引物并通过RACE方法扩增获得茎瘤芥抗逆基因BjEFhl，基因编码189个氨 基酸，NCBI比对预测具有1对EF-hand结构域，推测属于钙结合蛋白家族成员；通过构建 BjEFhl基因植物表达载体，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创制耐逆境新种质，提高植 物的逆境耐受力特性，尤其是耐盐特性，可进行植物品种改良。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为本发明BjEFhl基因编码区序列PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；
[0013] 图2为本发明重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjEFhl的构建流程图；
[0014] 图3为本发明T1代转BjEFhl基因拟南芥在含潮霉素（25mg/L)的MS培养基上的 筛选摄影图；
[0015] 图4为本发明转基因型拟南芥和野生型中的BjEFhl基因表达水平检测图；
[0016] 图5为本发明正常条件下野生型与转基因型拟南芥发芽率的统计图；
[0017] 图6为本发明NaCl条件下野生型与转基因型拟南芥发芽率的统计图；
[0018] 图7为本发明NaCl条件下野生型与转基因型拟南芥根的长度统计图；
[0019] 图8为本发明NaCl条件下野生型与转基因型拟南芥根的生长对比摄影图；
[0020] 图9为本发明NaCl条件下转BjEFhl基因拟南芥和野生型拟南芥耐盐能力对比摄 影图；
[0021] 图10为本发明NaCl条件下野生型与转基因型拟南芥的存活率统计图。
【具体实施方式】
[0022] 下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作 用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明 精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。
[0023] 实验例1 :莖瘤芥抗逆基因BjEFhl的克隆
[0024] 1主要试剂：柱式小量植物总RNA抽提试剂盒（W7021)购自上海华舜生物技术 有限公司；DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；5'-FullRACEKit试剂盒、 M-MLV反转录酶、PremixExTaq、DL2000DNAMarker、pMD19-T载体均购自大连宝生物工程 有限公司。
[0025] 2实验方法与步骤
[0026] BjEFhl基因序列片段SEQIDN0. 4的获取：采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒 方法提取获得茎瘤芥瘤茎的总RNA，总RNA取小部分通过紫外分光光度计检测0D260/0D280 的比值为1. 93,通过琼脂糖凝胶电泳28S的亮度约是18S的2倍，说明RNA的纯度高且无降 解，达到实验要求。将总RNA样品送北京华大基因研究中心进行转录组测序（RNA-seq)，方 法为用带有Oligo(dT)的磁珠富集莖瘤芥总RNA中的mRNA，加入fragmentationbuffer将 mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入缓冲 液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二条cDNA链，在经过QiaQuickPCR试剂 盒（Qiagen公司）纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly(A)并连接测序接头， 然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库（200bp)用 IlluminaHiSeqTM2000进行测序。通过对测序结果进行注释，选取可能的钙结合蛋白片段 序列SEQIDNO. 4,然后根据该片段序列进行基因全长的克隆以及功能分析。
[0027] 2.lBjEFhl基因5'端未知序列扩增
[0028] 2. 1. 1总RNA提取和反转录：采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒方法提取获得 茎瘤芥瘤茎的总RNA，然后取约1yg总RNA通过5'-FullRACEKit试剂盒方法去磷酸化、 去帽子、加接头，最后反转录获得cDNA第一链。
【权利要求】
1. 茎瘤芥抗逆基因BjEFhl，其特征在于：其基因序列为SEQ ID NO. 1。
2. 茎瘤芥抗逆基因蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO. 3所示。
3. 茎瘤芥抗逆基因BjEFhl的重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjEFhl，其特征在于：由 权利要求1所述SEQ ID NO. 1序列连入植物表达载体pCAMBIA1302构成。
4. 茎瘤芥抗逆基因BjEFhl在提高植物耐逆境特性的应用，其特征在于：所述耐逆境特 性为耐盐特性。
【文档编号】C12N15/82GK104328127SQ201410606963
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】向浏欣, 汪露, 刘吉军, 王小艳, 郑慧, 邓朝伟, 高翔 申请人:重庆邮电大学