专利名称：共表达gdnf和bdnf的转基因神经干细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗帕金森氏病的共表达神经营养因子GDNF和BDNF的 转基因神经干细胞系的构建，其所在的技术领域与生命科学和生物医药技术有 关。
背景技术：
胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)是由脑组织中的神经胶质细胞产生、分 泌的一种有着重要生物功能的神经细胞营养因子。GDNF对中枢和外周的多种神 经细胞具有较为广泛的神经营养作用，是目前发现的对多巴胺神经元和运动神 经元作用最为显著的一类神经营养因子，有较广泛的促进神经元生长和分化的 作用，尤其对多巴胺神经元作用最强(LinLTetal. Science 1993. 260(5111): 1130-2; Henderson et al. Science 1994， 266(5183): 1062-4)。近年在动物 与人活体实验证明GDNF在治疗缺血性脑损伤，肌萎縮侧索硬化和帕金森氏病有 较好作用，是当今国际上治疗帕金森氏病的热门研究领域之一。
国内外对GDNF的功能进行了广泛的研究。国外在动物或人体都是通过病 毒载体的基因治疗或导管直接给药对GDNF研究的(Do Thi NA， et al: Gene Ther. 2004 Jan 15)。通过病毒载体的基因治疗或导管给药显示出一定程度的临 床治疗效应，但需要反复多次应用才行。近年在帕金森氏病患者的单侧豆状核 注入GDNF的临床研究，显示有显著的、持续的双侧症状改善效果，而无明显不 良反应(Slevin JT， et al: Neurosurg Focus. 2006 May 15;20(5); Slevin JT,et al: J Neurosurg. 2005 Feb;102(2):401; Gill SS， et al: Nat Med. 2003 May ;9 (5) :589-95)。
另一神经营养因子，脑细胞源性神经营养因子(BDNF，下同)是由脑细胞产 生、分泌的一种有着重要生物功能的神经细胞营养因子。BDNF对中枢和外周的 多种神经细胞具有较为广泛的神经营养作用，如促进某些神经群的生存和分 化，调控神经突轴的轫力，并与海马的学习、记忆以及脊髓疼痛机制有关等 (Pezet S et al: Expert 0pin Ther Targets. 2004 Oct;8(5):391-9)。
更重要的是，BDNF对多巴胺神经元的生存和生长有重要作用。它具有阻止 凋亡细胞的死亡，增加酪氨酸水解酶阳性神经元的生存和此神经元纤维的生长 (Ostergaard K， et al: Exp Neurol. 1996 Dec;142(2):340-50; Tang FI, et al: Exp Brain Res. 1998 Apr; 119(3) :287-96; Singh S， et al: Indian J Exp Biol. 2006 S印;44 (9) :699-704:胡旭东等.神经解剖学杂志，1998年02期)。 研究证明数种中枢神经系统疾病与此BDNF支持减少相关连。因此，BDNF作为一
种强效神经保护因子，被认为是治疗某些中枢神经系统疾病的一个好的候选因 子(Pezet S， et al: Expert Opin Ther Targets, 2004 Oct;8(5):391-9)。
由于GDNF和BDNF具有上述重要生理功能，研究人员就BDNF和GDNF对冶疗 中枢神经系统退行性疾病-帕金森氏病的作用进行了研究。研究证明帕金森 氏病黑质神经元BDNF表达比正常对照显著减少(HowellsDW， etal: Exp Neurol. 2000 Nov;166(1) :127-35); Sun M,等应用表达GDNF、 BDNF的单纯性疱疹病毒 载体，在鼠帕金森氏病动物模型上，定向注入脑纹状体，分别观察GDNF、 BDNF 及其二者对帕金森氏病鼠动物黑质纹状体多巴胺神经元的保护作用以及行为缺 陷纠正的作用进行了观察，发现GDNF作用在行为缺陷纠正的作用方面比BDNF作用更显著，但并末能增加多巴胺神经元的数量(SunM， etal: Brain Res. 2005 Aug 9; 1052(2) :119-29)。同样，Singh S，等的研究也映证Sun M的结果(Singh S et al: Indian J Exp Biol. 2006 S印;44(9):699-704)。此外，有研究证明 接受GDNF和BDNF综合治疗的老鼠，其多巴胺系统纹状体的存活的活性纤维数 量较对照组和单用GDNF组增多，并能刺徼内源神经干细胞，使其迁移到纹状体 (Torp R et al: Tidsskr Nor Laegeforen. 2006 Mar 23;126(7):899—901)。
近年来，随着干细胞的发现，研究人员对包括胚胎干细胞、骨髓干细胞和 神经干细胞等进行了广泛深入的基础研究，证明干细胞具有分化多向性和可导 向性，同时证明干细胞没有或几乎没有免疫原性(Zeng SL et al:细胞与分子 免疫学杂志.2006 Jan;22(1) :110-2)。这些基础研究为临床应用奠定了坚定实 基础。目前研究人员在临床上应用上述干细胞对多种疾病的治疗开展了应用研 究，取得可喜的成绩，显示了干细胞临床上治疗多种难治性疾病的巨大前景。
神经干细胞(NSCs)由于具有高度自生和神经分化能力，已被用于 实验动物模型帕金森氐病的治疗(YasuharaT, st al: J Neurosci. 2006 Nov29:26(48): 12497-511; Kim SU， st al: Neuropathology. 006Apr;26(2):129-40; Iacovitti L， et al: Brain Res. 2007 Jan 5; 1127 (1) : 19-25)。这些研究结果显示神经干细胞移植到6-羟基多巴胺损 害的鼠纹状体后，与在受损纹状体部位单次或连续微泵注入神经营养因子相比 较，帕金森氐病症状有显著改善，而且，在移植区有内源性神经发生激活，并认 为是由于神经营养因子BDNF的分泌和神经分化的作用而发挥神经保护作用。此 外，为了获得产生多巴胺的神经干细胞，研究人员(Park S et al: Neurosci Lett. 2003 Dec 19; 353 (2) :91-4)，将酪氨酸羟化酶(TH)和GTP环水解酶基因共导入神经干细胞，移植后，动物帕金森氐病症状的改善明显，认为酪氨酸羟化酶(TH) 和GTP环水解酶基因遗传导入的神经干细胞在帕金森氐病患者的细胞替代疗法 中有很大的潜力。亦有应用酪氨酸羟化酶(TH)和BDNF或GTP环水解酶遗传修饰 的纤维母细胞、星状细胞和人胚胎干细胞(Duan D et al: Exp Brain Res. 2005 Mar:161(3):316-24. ; Wang ZH et al: Neuroscience. 2002;113(3):629-40), 对帕金森病动物模型进行研究，均有较好的疗效。
综上所述，神经干细胞由于其神经分化能力、分泌神经营养因子和无免疫 原性，用于临床上治疗神经退行性疾病和/或中枢神经系统其他相关疾病是可行 的。而且转基因神经干细胞将更具有针对性、是可行和有效的。
本发明基于以上的研究，为了更有效地治疗神经退行性疾病，弥补神经干 细胞自身表达神经营养因子的不足，建立高表达GDNF和BDNF的转基因神经干细 胞，通过定位移植技术，用于神经退行性疾病-帕金森氐病的治疗将是可行的。
发明内容
本发明的目的是通过构建一种共表达人源神经营养因子GDNF和BDNF的转 基因神经干细胞，形成一种能用于治疗神经退行性疾病-帕金森氏病的新型神经 干细胞。本发明的新型神经干细胞，其主要特征为
1) .神经营养因子GDNF和BDNF为人源的，是成熟型基因序列；
2) .神经营养因子GDNF和BDNF的N-末端连接着人白细胞介素-2的分泌先导序 列；此先导序列由20个氨基酸构成；
3) .笫2)款所述的神经营养因子GDNF和BDNF是由CMV启动子驱动、通过内部 核糖体结空合位点(IRES)连结形成的共表达质粒结构；4).神经干细胞为人源的、是通过电击法将共表达GDNF和BDNF表达质粒导入 而形成的一种具有高表达神经营养因子GDNF和BDNF功能特点的新型神经干细 胞。
附图l:人神经营养因子(GDNF)基因cDNA片段(RT-PCR)产物.第一泳道为 脱氧核苷酸(DNA,下同)分子量标准；第二和第三泳道为该基因反向转录酶-聚 合酶链反应(RT-PCR)产物。箭头所指为该基因cDNA片段在琼脂糖电泳上的位置。
附图2:重组人神经营养因子(GDNF)的表达。此图为转化细菌后的表达产物 在SDS-PAGE胶经卡马氏亮兰染色后的结果。从左向右起，第一泳道为标准蛋白 质分子量标记物;第二泳道为未诱导的细菌产物；第三和第四泳道为诱导的产 物。箭头所示为表达产物。
附图3:该基因GDNF在表达产物的Western Blot分析结果。第一泳道 为标准蛋白质分子量标记物；第二泳道为末诱导细菌产物；第三、第四和 第五泳道分别为不同诱导时间的产物。显示表达产物为符合预期的GDNF 基因产物。
附图4:人神经营养因子BDNF基因cDNA片段(RT-PCR)产物.第一泳道为脱 氧核苷酸(DNA,下同)分子量标准；第二泳道为该基因的反向转录酶-聚合酶链 反应(RT-PCR)产物。箭头所指为该基因cDNA片段。
附图5:重组人神经营养因子BDNF的表达。此图为转化细菌后的表达产物在 SDS-PAGE胶经卡马氏亮兰染色后的结果。从左向右起，第一泳道为标准蛋白质 分子量标记物:第二泳道为未诱导的细菌产物；第三泳道为诱导产物。箭头所示为表达产物。
附图6: pIRES-GDNF/BDNF表达盒结构图此表达盒图谱显示由位于N-未 端的CMV启动子、GDNF、 IRES、 BDNF和SV40多聚腺嘌呤组成，并以不同内切酶 位点相连接。
具体实施例方式
构建高表达神经营养因子GDNF和BDNF功能特点的新型神经干细胞首先需 要分别克隆人GDNF和BDNF基因；其次构建共表达人GDNF和BDNF基因的表达 质粒；再其次转染人神经干细胞，筛选、鉴定高表达GDNF和BDNF的神经干细 胞。
人胶质细胞源性神经细胞营养因子GDNF的克隆(包括人GDNF基因克隆及 其N未端的构建；原核表达质粒的构建和转化后在原核细胞的表达)。 实施例一、人GDNF基因克隆及其N未端的构建 以备制的人脑组织信息核糖核苷酸(mRNA)为模板，用Poly(T)引物在反向 转录酶作用下，合成人脑组织的互补脱氧核糖核苷酸(cDNA).然后以人脑组织 cDNA作为模板，用人工合成的，含有编码人白细胞介素-2分泌先导多肽核苷酸 和人GDNF基因N-末端序列核苷酸的正向引物和人GDNF基因C-末端序列核苷 酸的反向引物进行PCR扩增，进行人GDNF基因克隆及其N未端的改建，并在其 N-末端引入内切酶Nhel和Ndel位点，在其C-末端引入内切酶BamHl和HindUl 位点。引物l C-末端部份序列与引物2 N-末端部份序列相同(见下滑线)；引物 3 C-末端含GDNF的C-末端序列。
由于人白细胞介素-2分泌先导多肽核苷酸较长，故采用分步克隆法。即以人脑组织cDNA作为模板，先用引物2和引物3进行第一次PCR反应，再以此PCR 产物为模板，用引物1和引物3进行第二次PCR反应。 PCR引物设计如下 引物1(64 raer):
5， - gt|gctagccatatg[tacaggatgcaactcctgtcttgcattgcetctaagt;cttgcacttgt -3, 引物2(S3 mer):
5， - actaagtcttgcacttgtceicaaac￡Lgttctgagaagaagcgccggggatca-3, 引物3(34 mer):
5， —tcaagcttggatcctcagatacatccacaccttt -3，
PCR扩增产物经tai 1 ing加上腺嘌呤后，连接至T-easy载体，转化细菌后， 扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。
实施例二、含人GDNF基因原核细胞表达质粒的构建及其表达 用适当的内切酶，即Ndel和Hindlll分别消化上述含克隆的人GNDF的 T-easy载体和原核细胞表达载体Peal-n，用琼脂糖电泳分离，并进行纯化。 纯化后的人GNDF和原核细胞表达载体PCAL-N在连接酶作用下进行拼接。转化 细菌后，扩增、抽提、纯化，经内切酶消化DNA确定成功构建的含人GDNF基因 原核表达质粒。
实施例三、人BDNF基因克隆及其N未端的构建
以备制的人脑组织信息核糖核苷酸(mRNA)为模板，用Poly(T)引物在反向 转录酶作用下，合成人脑组织的互补脱氧核糖核苷酸(cDNA).然后以人脑组织cDNA作为模板，用人工合成的，含有编码人白细胞介素-2分泌先导多肽核苷酸 和人BDNF基因N-末端序列核苷酸的正向引物和人BDNF基因C-末端序列核苷 酸的反向引物进行PCR扩增，进行人BDNF基因克隆及其N未端的改建。并在其 N-末端引入内切酶Ncol和Smal位点，在其C-末端引入内切酶Xbal和Hindlll 位点。引物l C-末端部份序列与引物2 N-末端部份序列相同(见下滑线)；弓f物 3 C-末端含GDNF的N-末端序列。
同样，由于人白细胞介素-2分泌先导多肽核苷酸较长，故采用分步克隆法。 方法与实施例一相同。PCR引物设计如下 引物1(63 mer):
5， - gtccatggcccgggatgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgt -3，
引物2(55 mer):
5 ， — actaagtcttgcacttgtcacaaacagtcactctgaccctgcccgccgaggggag—3，
引物3(41 mer):
5， -gcctctagaaagcttctatcttccccttttaatggtcaatg -3， PCR扩增产物经tailing加上腺嘌呤后，连接至T-easy载体，转化细菌 后，扩增、抽提、纯化，经DNA测序确定。
实施例四、人BDNF基因原核细胞表达质粒的构建及其表达
用适当的内切酶，即Ncol和Hindlll分别消化上述含克隆的人BNDF的 T-easy载体和原核细胞表达载体pET-45b(+) DNA，用琼脂糖电泳分离，并迸 行纯化。纯化后的人BNDF和原核细胞表达载体pET-45b(+) DNA在连接酶作用 下进行拼接。转化细菌后，扩增、抽提、纯化，经内切酶消化DNA确定成功构建的含人BDNF基因原核表达质粒。实施例五、构建共表达GDNF和BDNF的表达质粒本实施例所用的载体 pIRESneo3为CloneTech公司产品，以此载体为骨架构建共表达GDNF和BDNF的 表达质粒。通过多次不同的内切酶消化、连接反应、感受态细菌转化和测序证 实，完成此表达盒构建。即以5-末端为Nhel和3-末端为BamHl内切酶位点的 GDNF片段，拼接于IRES的上游；以5-末端为Smal内切酶位点和3-末端为Xbal 内切酶位点的BDNF基因片段取代载体中的neo基因片段，拼接于SV40多聚腺 嘌呤的上游，而位于IRES的下游；至此，此共表达GDNF和BDNF的表达质粒 pIRES-GDNF/BDNF构建才告完成。将此pIRES-GDNF/BDNF表达质粒用脂质体导入真核细胞，观察由 cytomegalovirus (CMV)启动子驱动共表达GDNF和BDNF的状况。实施例六、转基因神经干细胞的构建在严格无菌条件下，采用常规细胞 培养法，按培养神经干细胞的特殊条件培养神经干细胞。取每毫升约一百万个 神经干细胞，加入5-10毫克pIRES-GDNF/BDNF表达质粒DNA，轻轻混匀，用 Bio-Rad公司生产的电击转化仪，电击转染神经干细胞。置于冰上约10分钟， 然后移至含适当抗生素的神经干细胞培养液的培养皿中，于二氧化碳培养箱、 37t静置培养过夜。实施例七、共表达GDNF和BDNF神经干细胞的分离鉴定待转染神经干 细胞长满后，采用稀释培养分离法，收集培养细胞上清液，进行westernblotting反应和PT-PCR反应，确定是否及高表达GDNF和BDNF的神经干细胞， 然后据此分离髙表达GDNF和BDNF的神经干细胞，进行扩增培养。实施例八、共表达GDNF和BDNF的转基因神经干细胞的应用应用外科 神经核定位技术及输送糸统，将共表达GDNF和BDNF的转基因神经干细胞定点 移植至引发帕金森氏病的神经核团，如绞状体、豆状核和黑质等。序列表Individual ApplicantStreet :广州市国际企业孵化器A区610房City :广州市State :广东省Country :中国PostalCode : 510633PhoneNuraber : 020-32290208FaxNumber : 020-32290208EmailAddress : shangwu一w錢yahoo- com 〈110> Us衡me :王 <110> FirstNeune :尚武 〈110> Middlelnitial : <110> Suffix :Application Project<120> Title :构建共表达GDNF和BDNF转基因神经干细胞的方法〈130> AppFileReference :<140〉 CurrentAppNufflber : 1〈141> CurrentFilingDate : 2007.05.05Sequence〈210〉 1 <211〉 490 〈212> ■〈213〉 GDNF人工序列 <400〉 1gtgctagccatstgtacacctgtcttgc3ttgC3Ct33gtcttgc3cttg60ttc3cc3gggc3gtgcttcct3g33g3g3gcggwtcggc120aggctgcagcggtcggagaggccsgaggggcs180a333ccggggttgtgtcttsactgcsstgtcsctgscttgggtctgggct240ettgs33cc33tgatttttsggtsctgcsgcggctcttgcg300caacgtacgatg33aaacttstccsgsasttgagtgscaasg360tsgggcaggcatgttgcag3ccc3tcgcctttgstg3tgacctgtcgtttttagatgata4203cctggttt3ccatattcttccgct333sggtgtggstgtstctgaggat480cc33gcttgs490<210> 2 <211> 154 <212> PRT〈213> GDNF人工序列 <400〉 2Met Tyr Arg Met Gin Leu Leu Ser Cys lie 1 5 10Leu Val Thr Asn Ser Ser Pro Asp Lys Gin20 25Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala35 40Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg50 55Cys Val teu Thr Ala lie His Leu Asn Val65 70Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu lie Phe80 85Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp95 100Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp110 115Cys Cys Arg Pro lie Ala Phe Asp Asp Asp125 130Asp Asn Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys140 145Cys Gly Cys lie 154Ala Leu Ser Leu Ala 15Met Ala Val Leu Pro 30Ala Asn Pro Glu Asn 45Gly Lys Asn Arg Gly 60Thr Asp Leu Gly Leu 75Arg Tyr Cys Ser Gly 90Lys lie Leu Lys Asn 105Lys Val Gly Gin Ala 120Leu Ser Phe I>eu Asp 135His Ser Ala Lys Arg 150<210〉 3 <211〉 436 <212〉廳〈213〉 BDNF人工序列 <400> 3gtcccggg3tgtacaggatgcaactcctgtcttgc3ttgcactaagtcttgcacttgtca60C333C3gtC3ctctgsccctgcccgccgaggggagctgsgcgtgtgtgsc3gt3ttsgtg120agtgggtaacggcggcsgsccsgtggscstgtcgggcgggscggtc3C3g180ggtccctgt3tc3335tggcc3t3CttC"t3Cgagaccaagt240gcasitcccstgggttsc3C3gcaggggcatC3ttgg33ct300cccagtgccgtcgtacgtgcgggcccttaccatggatagc360ttggctggcgsttc3t33ggatsgscscttcttgtgtstgt3csttgscc420gaagstagtctagagt436〈210> 4 <211〉 144 <212> PRT<213〉 BDNF人工序列 〈400〉 4Met Tyr Arg Met Gin Leu Leu Ser Cys 1 5L>eu Val Thr Asn Ser His Ser Asp Pro 20Ser Val Cys Asp Ser lie Ser Glu Trp 35Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly 50Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gin ILeu 65Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr 85lie Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin 100Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser 115Arg Phe lie Arg lie Asp Thr Ser Cys 130Lys Arg Gly Arg 144lie Ala Leu 10Ala Arg Arg 25Val Thr Ala 40Thr Val Thr55Lys Gin Tyr 70Lys Glu Gly 90Cys Arg Thr 105Lys Lys Arg 120Val Cys ThrSer Leu Ala 15Gly Glu Leu 30Ala Asp Lys 45Val Leu Glu 60Phe Tyr Glu 80Cys Arg Gly 95Thr Gin Ser 110lie Gly Trp 125Leu Thr lie135 140
权利要求
1、一种共表达神经营养因子GDNF和BDNF的表达质粒本发明构建的表达质粒以pIRESneo3载体为骨架，经改造形成本发明的共表达神经营养因子GDNF和BDNF的表达质粒，其表达盒具有以下主要特征a).神经营养因子GDNF和BDNF基因均为编码GDNF和BDNF成熟蛋白氨基酸序列的核苷酸序列；b).神经营养因子GDNF和BDNF基因的N-末端均连结着人白细胞介素-2的分泌先导序列，此分泌先导序列由编码20个氨基酸(MYRMQLLSCIALSLALVTNS)的60个核苷酸组成；c).神经营养因子GDNF和BDNF基因是通过内部核糖体结合位点(IRES)连接的；GDNF基因位于内部核糖体结合位点上游、而BDNF位于内部核糖体结合位点的下游、SV40多聚腺嘌呤的上游；d).CMV启动子驱动神经营养因子GDNF和BDNF基因的共表达。
2、 根椐权利要求1， 一种CMV启动子驱动共表达驱动神经营养因子GDNF和BDNF 基因的表达盒，其含有下列氨基酸序列和具有转录功能的脱氧核苷酸序列a) .亲本源于人的神经营养因子GDNF和BDNF基因成熟蛋白氨基酸序列和具 有转录功能的脱氧核苷酸序列；b) .内部核糖体结合位点(IRES)源于脑心肌炎病毒。
3、 根椐权利要求l，表达盒中共表达的GDNF基因既可位于IRES的上游，也可 位于其下游；BDNF亦如此
4、 根椐权利要求1和要求3，本发明由CMV启动子驱动共表达的、位于IRES 上游的基因GDNF、位于IRES下游的基因BDNF基因；但不限于神经营养因子， 也包括酪氨酸羟化酶(TH)和GTP环水解酶或其他神经细胞因子基因。
5、 本发明应用的神经干细胞亲本为人源的，但不限于神经干细胞，也包括人胚 胎干细胞、星状细胞和纤维母细胞。
6、 根椐权利要求l，由本发明构建的共表达GDNF和BDNF的pIRES-GDNF/BDNF 表达质粒经电击转染神经干细胞所形成的转基因神经干细胞及其在治疗神经退 行性疾病和/或其他中枢性神经系统疾病的应用。
全文摘要
本发明描叙了一种构建共表达GDNF和BDNF的转基因神经干细胞的方法及其用途和意义，其主要特征为1)表达的GDNF和BDNF亲本为人源的、为编码成熟GDNF和BDNF蛋白的核苷酸序列；2)GDNF和BDNF的N-未端连结人IL-2分泌先导序列，表达的重组GDNF和BDNF为分泌型蛋白；3)构建的表达质粒含有由CMV启动子驱动，通过内部核糖体结合位点(IRES)连结GDNF和BDNF的表达盒；4)神经干细胞为人源的，应用电击转导法，使其为共表达GDNF和BDNF的转基因神经干细胞；本发明的转基因神经干细胞，弥补了神经干细胞自身GDNF和/或BDNF的不足，为临床冶疗神经退行性疾病-帕金森氏病和/或其他中枢神经系统疾病提供了一种转基因神经干细胞治疗新途经。
文档编号A61K35/30GK101302529SQ20071002783
公开日2008年11月12日 申请日期2007年5月8日 优先权日2007年5月8日
发明者徐评议, 王尚武 申请人:王尚武;徐评议