具有促进干细胞分化的支架材料及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种支架材料，尤其涉及一种由若干种材料交联而成的支架材料，具有促进干细胞分化的作用，以及制取的方法和用途。

背景技术：

外伤骨折、炎症、肿瘤和先天异常等均会造成骨缺损，将人工支架材料植入骨缺损处是国际公认的骨缺损修复方法。目前在研的生物支架普遍存在生物惰性问题，主要表现为缺乏骨诱导活性，不能有效诱导自体骨再生，尤其对于眼眶骨这类骨壁菲薄，骨髓腔少，局部血供差，骨再生能力弱的骨组织，缺损骨的自我修复更加困难。为了提高支架材料的骨诱导活性，有大量研究利用干细胞基因调控(Int.J.Mol.Med.，2010，26，517～525)和生长因子诱导等方法(PNAS，2014，111，12847～12852；Biomacromolecules，2014，15，1019～1030)提高支架材料修复骨缺损的能力，但是却面临生物安全性、生长因子活性和经济成本等新的问题。因此，从根本上提高支架材料的生物活性是发展组织工程支架材料的关键。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种支架材料，具有良好生物活性，不仅可以通过纳米材料的化学活性诱导干细胞的分化，而且能够通过支架材料表面微纳结构调控干细胞的分化。

本发明的另一个目的在于提供一种支架材料，不仅可以通过纳米材料的化学活性诱导干细胞的骨向分化，而且能够通过支架材料表面微纳结构调控干细胞骨向分化。

本发明的再一个目的在于提供一种制取支架材料的方法，通过化学交联反应制备具有良好促进组织再生功能的纳米复合生物活性支架。

本发明的又一个目的在于提供一种制取支架材料的方法，通过化学交联反应制备具有良好促进骨再生功能的纳米复合生物活性支架。

本发明的又一个目的在于提供一种支架材料在组织修复中的应用。

本发明的又一个目的在于提供一种支架材料，在骨缺损修复中的应用。

一种支架材料，其内部为多孔结构，孔隙率为90％以上，空隙外径为200±10μm。

另一种支架材料，其表面的羟基含量为40mol％～50mol％。使用boehm滴定法可对支架材料表面的官能团进行定量分析

另一种支架材料，其表面的羧基含量为40mol％～50mol％。使用boehm滴定法可对支架材料表面的官能团进行定量分析。

另一种支架材料，其表面具有羧基和羟基等基团，还具有纳米级的凸起结构，凸起高度为1nm～100nm。

另一种支架材料，包括碳基纳米材料，天然高分子和一维无机纳米材料，碳基纳米材料与天然高分子之间经由酰胺键互交联，天然高分子之间经由酰胺键自交联，一维无机纳米材料吸附于天然高分子。

另一种支架材料，按重量份，包括0.1～1碳基纳米材料、1～5天然高分子和1～5一维无机纳米材料。

碳基纳米材料如：但不仅限于氧化石墨烯，石墨烯量子点和碳纳米管等。

天然高分子材料如：但不仅限于胶原蛋白，水溶性壳聚糖和丝素蛋白等。

一维无机纳米材料如：但不仅限于纳米羟基磷灰石纳米粒子(nHA)、纳米二氧化硅纳米粒子(nSiO₂)等，粒径为1nm～100nm。

一种制取支架材料的方法，包括如下步骤：

先制得浓度1w/v％～5w/v％天然高分子(如：2w/v％)和浓度0.1w/v％～1w/v％碳基纳米材料(如：0.2w/v％)的混合液，再加入一维无机纳米材料(如：浓度至1w/v％～5w/v％)，一维无机纳米材料经静电吸附作用而吸附于天然高分子上，制得一维无机纳米材料/碳基纳米材料/天然高分子混合水溶液；

加入缩合剂和活化剂，搅拌均匀后，室温静置交联2小时，得纳米复合水凝胶；

所得纳米复合水凝胶进行预冰冻处理(如：放置-40℃冰箱里24hr)，之后进行冷冻干燥，得到支架材料预产物，用去离子水超声清洗3次，每次5分钟，再经冷冻干燥，得到支架材料。

缩合剂如：但不仅限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，J.Org.Chem.1961，26，2525)。

活化剂如：但不仅限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

本发明的支架材料具有组织诱导活性，无需使用组织分化培养基，即能促进接种其上的细胞(如：骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞)进行组织分化，如：

在支架材料上接种干细胞，体外非成骨分化培养基培养7天，待细胞贴壁增殖良好后，将纳米复合支架材料移植到体内非承重骨(如：眼眶骨和颅盖骨)骨缺损处，移植后随访观察3月，CT检查缺损部位骨修复效果良好。

由此可见，在目前大部分细胞成骨分化都是在分化培养基的培养条件下进行，本发明具有在非成骨分化培养基培养环境下，三维支架通过化学诱导作用和表面微纳结构作用促进细胞成骨分化。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明提供的支架材料，是具有良好组织诱导(如：硬骨组织诱导和软骨组织诱导)活性的纳米复合支架材料，不仅可以通过纳米材料的化学活性诱导干细胞的分化(如：骨向分化，以及向软骨分化等)，而且能够通过支架材料表面微纳结构调控干细胞的分化(如：骨向分化，以及向软骨分化等)。

在非承重骨(如：眼眶骨和颅盖骨)骨缺损时，作为组织工程支架体外接种干细胞后，移植在缺损部位，促进新骨的再生并修复缺损骨组织。

附图说明

图1A为本发明nHA/GO/CMC交联10分钟后的形貌图；

图1B为本发明nHA/GO/CMC交联2小时后的形貌图；

图2A为本发明nHA/GO/CMC支架材料形貌图；

图2B为本发明nHA/GO/CMC支架材料扫描电镜图；

图3为本发明细胞成骨分化后成骨相关因子基因表达水平图；

图4为本发明细胞成骨分化后成骨相关蛋白表达水平凝胶电泳图；

图5为本发明细胞在nHA/GO/CMC复合支架生长7天后碱性磷酸酶染色结果和生长14天后茜素红染色结果图；

图6为本发明细胞在nHA/GO/CMC复合支架生长7天后的荧光照片。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1支架材料修复大鼠颅盖骨缺损

(1)称取4g羧甲基壳聚糖(CMC)溶解于100mL去离子水中得到4％(w/v)CMC水溶液；称取0.4g氧化石墨烯(GO)溶解于100mL去离子水中，并超声(200W，80％)1个小时得到黄褐色透明0.4％(w/v)GO水溶液。

(2)取5mL 4％(w/v)CMC水溶液与5mL 0.4％(w/v)GO水溶液磁力搅拌混合，再放置在超声发生器中超声(200W，80％)分散1h，得到2％(w/v)GO和0.2％(w/v)CMC充分混合的水溶液。

(3)称取0.1g nHA加入到上述混合水溶液中，超声(200W，80％)分散1h，获得均匀分散的nHA/GO/CMC混合溶液。

(4)取上述10mL nHA/GO/CMC混合溶液中加入1mL 1mM EDC水溶液和250μL 1mM NHS水溶液并迅速搅拌均匀，将混合后的溶液放置在室温下静止10min，得到nHA/GO/CMC凝胶，并在室温下再静止2hr，得到充分交联的nHA/GO/CMC复合凝胶(如图1A和图1B)。

(5)将nHA/GO/CMC复合凝胶进行放置在-40度冰箱里进行预冰冻处理24hr，之后放置冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到nHA/GO/CMC复合支架预产物。

(6)将nHA/GO/CMC复合支架预产物放置在去离子水中超声清洗3次(每次5min)，去掉反应副产物，再进行冷冻干燥，获得nHA/GO/CMC复合三维多孔支架待用，三维多孔支架孔径大小为200±10μm，孔隙率为90％，支架表面呈现微纳粗糙结构(如图2A和图2B)。

(7)将nHA/GO/CMC复合三维多孔支架铺板在6孔板中，并接种大鼠来源骨髓间充质干细胞(rBMSCs)后，用非成骨分化培养基(10％FBS、90％DMEM培养基和1％青链霉素)培养细胞7天、14天后，提取细胞tRNA，反转录为cDNA后，通过荧光定量PCR分析检测成骨相关因子如：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨钙素(osteocalcin，OCN)和骨桥蛋白(osteopontin，OPN)的基因表达水平，相对于对照组(CMC三维多孔支架、GO/CMC复合三维多孔支架)，实验组(nHA/GO/CMC复合三维多孔支架)基因表达水平显著上调(P＜0.05)(参见图3)，同时在rBMSCs培养7天后，提取细胞总蛋白，从蛋白水平检测分析成骨相关蛋白(BSP，OCN，OPN)的表达水平，结果显示成骨相关蛋白在实验组(nHA/GO/CMC复合三维多孔支架)的表达水平最高(图4)。

(8)将nHA/GO/CMC复合三维多孔支架铺板在6孔板中，并接种大鼠来源骨髓间充质干细胞(rBMSCs)后，用非成骨分化培养基(10％FBS、90％DMEM培养基和1％青链霉素)培养细胞7天后进行碱性磷酸酶(ALP)染色，培养14天后进行茜素红(ARS)染色，染色结果显示实验组(nHA/GO/CMC复合三维多孔支架)较对照组(CMC三维多孔支架、GO/CMC复合三维多孔支架)有明显的细胞外基质矿化现象(参见图5)。

(9)将nHA/GO/CMC复合三维多孔支架修剪为直径为5mm，高度为1.2mm原片，将1×10⁶大鼠来源骨髓间充质干细胞(rBMSCs)接种在nHA/GO/CMC复合三维多孔支架上，体外用非成骨分化培养基培养7d，待细胞贴壁并增殖良好(如图6)。

(10)选用6周～8周龄雌性SD大鼠，无菌状态下使用5％戊巴比妥(剂量为3.5mg/100g)行腹腔麻醉，使用75％酒精消毒大鼠颅骨皮肤，并做1.0cm纵向切口，依次切开皮肤、皮下组织、肌肉、骨膜层，钝性分离骨膜，暴露颅骨组织。用外径5mm的环钻在大鼠颅骨上制作直径5mm的圆形全层骨膜骨质缺损，然后仔细冲洗创面，去除残留碎骨。严密止血后，将上述nHA/GO/CMC复合三维多孔支架填充于缺损区，使用5-0缝线逐层缝合骨膜和皮肤。

(11)术后12周，经腹腔注射过量戊巴比妥以处死实验大鼠。标本使用4％福尔马林固定24h。然后，将各组样品行Micro-CT检测，20μm层扫，并进行三维重构，通过系统自带软件分析新生骨体积占总体积百分比(BV/TV)，达到新骨形成量80％以上。

实施例2支架材料修复犬眼眶骨缺损

(1)称取4g胶原蛋白(Col)溶解于100mL去离子水中得到4％(w/v)Col水溶液；称取0.4g GO溶解于100mL去离子水中，并超声(200W，80％)1个小时得到黄褐色透明0.4％(w/v)GO水溶液。

(2)取5mL4％(w/v)Col水溶液与5mL0.4％(w/v)GO水溶液磁力搅拌混合，再放置在超声发生器中超声(200W，80％)分散1h，得到2％(w/v)Col和0.2％(w/v)GO充分混合的水溶液。

(3)称取0.2g纳米二氧化硅(nSiO₂)加入到上述混合水溶液中，超声(200W，80％)分散1h，获得均匀分散的nSiO₂/GO/Col混合溶液。

(4)取上述10mL nSiO₂/GO/Col混合溶液中加入1mL 1mM EDC水溶液和250μL 1mM NHS水溶液并迅速搅拌均匀，将混合后的溶液放置在室温下静止10min，得到nSiO₂/GO/Col凝胶，并在室温下再静止2hr，得到充分交联的nSiO₂/GO/Col复合凝胶。

(5)将nSiO₂/GO/Col复合凝胶进行放置在-40度冰箱里进行预冰冻处理24hr，之后放置冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到nSiO₂/GO/Col复合支架预产物。

(6)将nSiO₂/GO/Col复合支架预产物放置在超纯水中超声清洗3次(每次5min)，去掉反应副产物，再进行冷冻干燥，获得nSiO₂/GO/Col复合三维多孔支架待用。

(7)将nSiO₂/GO/Col复合三维多孔支架修剪为直径为8mm，高度为1.2mm原片，将1.5×10⁶犬来源间充质干细胞(bBMSCs)接种在nSiO₂/GO/Col复合三维多孔支架上，体外用非成骨分化培养基培养7d，待细胞贴壁并增殖良好。

(8)选成年比格犬全麻后于下眶缘切口分离至内下眶缘，切开骨膜暴露眶内侧壁，模拟人眶内下壁骨缺损的状况，用骨科环钻钻除眶内下壁直径8mm大小的全层圆形骨组织，去除局部的骨膜和筛窦粘膜，严密止血后，将上述nSiO₂/GO/Col复合三维多孔支架填充于缺损区，分层关闭切口。术后3月进行犬眼眶CT扫描，观察眼眶骨缺损自行修复情况，新骨形成量达80％以上。测量犬双侧眼球突出度及对称情况，并观察眼球运动情况，眼球运动良好，对称情况良好，并无突出。