专利名称：Lmx1a介导的与神经干细胞共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法
技术领域：
本发明属于分子细胞生物学，特别是诱导干细胞替代缺损的神经元细胞以治疗帕金森氏病的方法。
背景技术：
帕金森氏病(Parkinson，s disease, PD)是一种中老年常见的慢性神经系统退行性变性疾病，主要病理特征是黑质多巴胺(Dopamine，DA)能神经元的选择性变性丢失和残存于神经元内含大量a-突触核蛋白(a-synuclein)、synphilin_l和Parkin等成分的路易小体(Lewy bodies)形成对于帕金森氏病。临床治疗多以药物治疗为主，不能从根本上去除病因，也不能延缓疾病的进程，而且随着长期用药和疾病的发展，效果进行性下降，副作用日趋严重。在脑血管病人增加、与环境污染导致的重金属和化学物质接触以及生活压力等多重因素影响下，帕金森病呈增长趋势，出现年轻化，患者和社会的负担越来越重。细胞替代治疗是重建受损神经系统的组织结构，恢复神经系统功能的一种有效策略。按照传统观念，成年哺乳动物的中枢神经系统(central nervous system, CNS)属于完全有丝分裂后的组织，不具有自我更新和修复的能力。因此，研究者把重建神经系统功能的重点放在胚胎组织的移植上，利用胚胎脑组织移植治疗神经系统疾病动物模型和患者，在实验和临床研究中取得了成功的经验。但移植胚胎组织存在形成畸胎瘤的风险和伦理道德要求，限制了移植治疗的广泛应用。因此，较为理想的方法就是找到能产生多巴胺的细胞或能分化成多巴胺能神经元的干细胞，从根本上解决多巴胺能神经元细胞的来源。研究早期，研究人员将胚胎干细胞直接移植到帕金森病小鼠模型体内，胚胎干细胞可以部分分化为TH阳性的神经元，但把小剂量的胚胎干细胞移植到帕金森病小鼠模型黑质核团，数周后约 20%的小鼠的大脑内出现畸胎瘤。细胞替代疗法尤其是帕金森氏病的细胞治疗要解决的关键问题是选择合适的替代细胞。间充质干细胞由于具有组织修复特性、自我更新及增殖分化、取材简单、资源丰富等特点而成为了 ro细胞替代治疗的理想候选细胞。目前，尽管中胚层间充质干细胞向DA能神经元定向分化尚无十分高效的诱导方法，但却受到研究人员重视，其分子机制逐渐被揭示和认识。在胞外发育信号的诱导下，月旨肪来源的间充质干细胞(Rhesus adipose stem cells,rASCs)能够向其他的细胞系诱导分化，但其分化分子机制却知之甚少。研究表明，Lmxla是多巴胺能神经元发育过程中的关键调控因子，能够启动神经元细胞的发育程序，使小鼠胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元。但是，多巴胺能神经元的分化是多因素、多步骤诱导的复杂过程，需要细胞内部和外部多条信号通路在不同时间协调作用，激活多种转录因子，引起细胞广泛的基因表达谱的变化。神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)是存在于中枢神经系统中具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。除了在体内能分化为神经元、星形胶质细胞核少突胶质细胞外，还能够分泌大量的营养因子，如⑶NF、Neuturin等,对神经元细胞进行营养保护。
发明内容
本发明的目的是以恒河猴为研究对象，提供一种采集恒河猴的脂肪间充质干细胞进行体外培养，进而在Lmxla介导下与神经干细胞共培养将rASCs转分化为DA能神经元的方法。本发明Lmxla介导的与NSCs共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法，包括以下步骤:
步骤(I):构建Lmxla基因克隆及重组质粒 以 Lmxla whole transcript cDNA (NM_138396)为模板，引物为:
Pl up:5' -GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG-3',
Pl down:5' -CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG-3',
通过PCR扩增获得带Sal I和EcoR V酶切位点的DNA片段，将该片段插入pShuttIe-CMV中，通过SalI和EcoR V双酶切鉴定，得到重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmxla，测序并与理论
结果一致;
步骤(2):构建与包装重组腺病毒Ad-Lmxla
将步骤(I)重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmxla先后用PmeI线形化和CIAP进行5'去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组PAdEasy-1同时电转感受态细胞BJ-5183，得同源pAdEasy-1重组质粒,筛选阳性克隆,与pAdEasy-1成功进行同源重组的克隆能被PacI酶切出3.0kb或者4.5kb的片段；
筛选出的pAdEasy-1重组质粒经鉴定后转化XL_10 (Gold)，扩增、提取质粒,使质粒浓度达到0.1 ii g/ ii L，将质粒线性化后转染HEK-293细胞，使重组腺病毒质粒在HEK-293细胞中包装重组腺病毒重组腺病毒Ad-Lmxla，10天后细胞病变脱落呈串珠状，漂浮于上清液中，收集腺病毒颗粒；
步骤(3):将感染Ad-Lmxla的rASCs与NSCs共培养分化为DA能神经元Ca)诱导前,取rASCs第二代细胞,接种于放有玻片且包被过多聚赖氨酸的六孔培养板，培养液为含10%FBS的L-DMEM ;培养的NSCs接种于transwell小室中，培养液为含2%B27 的 Neural Basal 培养液。(b)以最佳MOI的Ad-Lmxla感染rASCs，并将培养液更换为含2% B27的NeuralBasal培养液，使细胞贴壁率维持在85%，三天后再换液为DMEM/F12诱导液I进行预诱导，部分细胞开始聚集；
(c)将接种有NSCs的transwell小室放入接种有(b)的产物细胞的六孔板中，NSCs与
(b)的产物细胞在含2% B27的Neural Basal培养液中共培养24h，细胞数目明显增多，3天后将诱导液换液为Neural Basal正式诱导液II，每隔3天换一次诱导液II，直至21天；以上DMEM/F12诱导液I由以下成分组成:
2%FBS,
1.7 m SHH,
20 ng/mLbFGF,
6 mM 3 -巯基乙醇，DMEM/F12培养基。以上Neural Basal正式诱导液II由以下成分组成:
2%B27,
1.7 m SHH,
100 ng/mLFGF-8,
20 ng/mLbFGF,
1% N2 supplement,
20 m & -NADP,
Neural Basal 培养基。所述的方法是步骤(3)中rASCs第二代细胞的培养:
Ca)氯胺酮麻醉恒河猴，无菌条件下取6kg成年恒河猴大网膜脂肪组织f2g。PBS中洗涤去除残存的血迹,分离血管和纤维成分，0.1%1型胶原酶，37°C消化Ih ；
(b)消化完成后，加入与I型胶原酶等体积的含10%新生小牛犊血清的L-DMEM培养液终止消化，过滤，1500 r/min离心3 min,弃上清,吸取底部沉淀用于rASCs培养；
(c)以1\106接种于1'-25培养瓶中，371:，5%0)2条件下细胞培养中培养4天，至单层贴壁细胞贴壁率接近90%时，0.25%胰蛋白酶消化，1:2传代，之后随细胞扩增至90%时，按1:2持续体外传代 培养。所述的方法是步骤(3)中NSCs的培养:
取孕14天的SD大鼠，在无菌条件下取出子宫置于预冷的Hanks缓冲液中，分离出SD胎鼠，在解剖显微镜下取腹侧中脑区，加入0.025%胰酶，37°C消化10 min,用DMEM/F12终止消化，吹匀，1500 r/min离心10 min，用含20 ng/mL bFGF和2%B27的DMEM/F12重悬细胞，接种至T-25培养瓶，悬浮培养；
每隔48h半量换液一次，每4天1:2传代一次，待细胞团增殖换液为新鲜的含2% B27的Neural Basal培养基。本发明的有益效果是:
本发明对克隆球贴壁分化后得到的细胞进行鉴定，发现至少60%细胞表达酪氨酸羟化酶(TH)，说明我们从中脑分离得到的NSCs更易分化为多巴胺能神经元细胞，能更多的释放促进细胞分化为多巴胺能神经元的细胞因子，含有细胞因子的NCM在整个诱导过程中起到很好的诱导作用。众所周知，细胞间联系对培养细胞的生长十分重要，以往文献中采用的培养神经干细胞的方法是将克隆球分散为单个细胞，该方法造成细胞的机械损伤，使得较多的细胞在传代后死亡。我们试验表明，分离神经干细胞关键的是吹打细胞的力度。本发明参照Clive分离培养方法减少了细胞死亡，较好的保留了细胞间联系，克隆球细胞群较多，增殖速度很快，能在短期内获得更多的干细胞，使Clive采用的干细胞传代方法，适合于神经干细胞研究。既往研究表明，理想的基因转移载体是进行基因修饰和治疗的关键。与其他间充质干细胞比，间充质干细胞不表达或低表达免疫排斥相关标记，免疫原性低，是一类免疫缺陷细胞，不须经过严格配对使用，异体移植无免疫排斥反应，适宜于不同个体之间的移植，这一点在治疗神经系统疾病方面显得尤为重要。恒河猴作为非人灵长类动物，分离得到的脂肪间充质干细胞与人类更为接近，与啮齿类动物研究相比，所取得的研究资料更为珍贵。本发明以ASCs为原料，取材方便且体外培养操作简单，可以为将来可能的临床实验研究提供充足的细胞源。多能干细胞分化为特定的组织细胞类型及相关分子机制研究一直是干细胞研究的重要方向，尤其是分子机制研究较少。研究表明，SHH/Lmxla/Msxl信号通路在早期DA神经元分化成熟过程中起到非常重要的调控作用，但在脂肪间充质干细胞分化为神经元研究中还未见报道。本研究提出SHH/Lmxla/Msxl信号通路结合NSCs共培养对多能干细胞分化为神经元细胞具有重要作用更属首例。本发明通过实验证明，在共培养环境中，通过腺病毒将Lmxla基因传递至rASCs能够使rASCs分化形成多巴胺能神经元细胞。Lmxla对rASCs的分化方向进行调控,与来源于胎鼠中脑的NSCs共培养后，在所指出的诱导方案下，分化出来的神经元样细胞能够表达多种特异性表达于多巴胺能神经元细胞中的蛋白标志物，可评价诱导rASCs为多巴胺能神经元细胞。本发明诱导后的细胞可以传导电信号或分泌神经递质，证明诱导细胞为神经元细胞。
图1是Lmxla基因克隆及其重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmxla筛选结果(A) I,DNA marker DL, 2000; 2，Lmxla PCR产物(1149bp) ; (B) I, J and K酶切分析重组质粒 pShuttleCMV-Lmxla ; 2, DNA marker DL, 15000。图2是重组腺病毒质粒pAdEasy-Lmxla和pAdEasy-NGF/NTN的筛选。1、2、3是重组腺病毒质粒经Pac I酶切，分别产生4.5kb和3.0 kb的片段；
4,DNA marker DL, 15000。图3是重组腺病毒在HEK-293中的包装产生的细胞病变(200 X )及透射电镜观察重组腺病毒负染结果。(A)对照细胞(B)病变细胞(C)重组腺病毒负染结果。图4是rASCs形态观察及BrdU荧光染色。图5是透射电镜观察rASCs多能性细胞特征。图6是rASCs向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化及鉴定(A)成脂诱导后的rASCs ；(B)油红0染色鉴定脂肪细胞；(C)ALP染色鉴定成骨细胞；(D)茜素红染色鉴定成骨细胞。图7是NSCs和由NSCs诱导的神经元的鉴定。图8是rASCs感染Ad-Lmxla与NSCs共培养诱导方案及细胞形态变化示意图。图9是RT-PCR和免疫荧光检测诱导rASCs特异性神经元蛋白转录和表达情况:(A)免疫荧光结果；(B) RT-PCR结果；(C)神经元特异性蛋白免疫荧光统计结果。图10是ELISA检测诱导rASCs多巴胺释放情况。以下结合附图对本发明做进一步说明。
具体实施例方式一、Lmxla介导的与神经干细胞共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法
(I)Lmxla基因克隆及重组质粒的构建以 Lmxla whole transcript cDNA (NM_138396)为模板，引物为:
Pl up:5' -GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG-3',
Pl down:5' -CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG-3',
通过PCR扩增获得带Sail和EcoR V酶切位点的DNA片段，通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测分析，扩增的条带与理论分子量吻合，结果见图1A。将扩增片段插入pShuttle-CMV中，通过Sal I和EcoR V双酶切鉴定，得到重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmxla，结果见图1B。重组克隆进行测序，测序结果与理论结果一致。以上 Lmxla whole transcript cDNA (NM_138396)购买自 GeneCopoeiaTM 公司。购买。(2)重组腺病毒的构建与包装
将步骤(I)重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmxla先后用PmeI线形化和CIAP进行5'去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组PAdEasy-1同时电转感受态细胞BJ-5183，得同源pAdEasy-1重组质粒，涂布含有卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，与pAdEasy-1成功进行同源重组的克隆能被PacI酶切出3.0kb或者4.5kb的片段，结果见图2。筛选出的pAdEasy-1重组质粒经鉴定后转化XL_10 (Gold)，扩增、提取质粒，使质粒浓度达到0.1 ii g/ ii L，将质粒线性化后转染HEK-293细胞，使重组腺病毒质粒在HEK-293细胞中包装重组腺病毒重组腺病毒Ad-Lmxla，10天后，细胞病变脱落呈串珠状，漂浮于上清液中，收集腺病毒颗粒，在透射电镜下可见典型腺病毒颗粒。见图3。(3)感染Ad-Lmxla的rASCs与NSCs共培养分化为多巴胺能神经元
Ca)诱导前,取rAS Cs第二代细胞,接种于放有玻片且包被过多聚赖氨酸的六孔培养板，培养液为含10%FBS的L-DMEM ;培养的NSCs接种于transwell小室中，培养液为含2%B27 的 Neural Basal 培养液。(b)按照图8的诱导方案，以最佳MOI的Ad-Lmxla感染rASCs,rASCs生长状态良好，出现少数细胞漂起，并将培养液更换为含2% B27的Neural Basal培养液，使细胞贴壁率维持在85%，三天后再换液为DMEM/F12诱导液I进行预诱导，部分细胞开始聚集；
以上DMEM/F12诱导液I由以下成分组成:
2%FBS,
1.7 m SHH,
20 ng/mLbFGF,
6mM 3 -巯基乙醇，
DMEM/F12培养基。(c)将接种有NSCs的transwell小室放入接种有(b)的产物细胞的六孔板中，NSCs与(b)的产物细胞在含2% B27的Neural Basal培养液中共培养24h，细胞数目明显增多，3天后将诱导液换液为Neural Basal正式诱导液II，每隔3天换一次诱导液II，直至21天；
以上Neural Basal正式诱导液II由以下成分组成:
2%B27,
1.7 m SHH,
100 ng/mLFGF-8,20 ng/mLbFGF,
1% N2 supplement,
20 m & -NADP,
Neural Basal 培养基。诱导21天后，发出细长的突触，相互连接最后交联形成网络状，诱导后细胞存活较好，结果如图8所示。(2)本发明方法的产物之多巴胺能神经元的鉴定
I) RT-PCR检测诱导后细胞的神经元特异性基因转录情况
提取诱导后的细胞和对照细胞的总RNA，提取步骤按试剂盒操作说明进行。抽提所得细胞总RNA使用比色法测定RNA浓度后，分别利用cDNA合成试剂盒进行cDNA第一链的合成。利用表I所示的所有基因引物对逆转录成的cDNA进行PCR，1%琼脂糖电泳检测PCR产物，并拍照记录。结果显示:与P -actin相比较,在对照rASCs细胞和诱导rASCs细胞中，Nurrl 和 3-tubulin III 均有转录。诱导 21 天时,诱导组中 Nurrl、0-tubulin II1、Nefm、nestin、GFRa 2基因转录水平上调，nestin在诱导后14天出现上调，并且多巴胺能神经元特异性基因TH也出现转录，结果如图9B所示。2)免疫荧光检测诱导后细胞的神经元特异性蛋白表达 对共培养诱导后的rASCs进行神经元特异性蛋白质NSE、P -tubuIinIII和TH免疫荧光检测。与对照细胞相比，在共培养诱导后21天时，诱导组细胞特异性表达NSE、^ -tubulin III和TH蛋白，未检测到MAP-2的表达，对荧光蛋白阳性细胞进行统计后，发现随诱导时间的延长，NSE、^ -tubulin III和TH的表达率不断增加(图9A)。3)诱导后神经元细胞多巴胺分泌测定
利用多巴胺检测试剂盒，测定诱导后的rASCs是否会释放神经递质多巴胺。结果显示，在本发明诱导方案下，Lmxla转导的rASCs在诱导后比不转导Lmxla的rASCs多分泌1.2倍的多巴胺，约为180pg/105细胞，而在Ad-LacZ感染后的未诱导的rASCs中不能检测到多巴胺的释放(图10)。二、本发明rASCs的培养及鉴定
无菌条件下，氯胺酮麻醉恒河猴，取恒河猴大网膜脂肪组织。PBS冲洗4遍，分离可见的血管和纤维成分，0.1% I型胶原酶，37 °C消化I h。消化完成后，加入与I型胶原酶等体积的含10%胎牛血清(FBS)的L-DMEM培养液终止消化，过滤，1500 r/min离心3 min,弃上清，吸取底部沉淀用于rASCs培养。培养的脂肪干细胞大部分于24 h内即贴壁，在倒置显微镜下观察，贴壁细胞呈梭形，胞浆丰富、核大、核仁明显，可见细胞呈克隆样生长。传代后，于倒置显微镜下可见成纤维样细胞形态，细胞呈平行排列生长或旋涡状生长，在形态上与骨髓来源的MSCs类似，通过BrdU掺入实验检测rASCs增殖指数为 40% (图 4)。为了鉴定rASCs的多能性，我们取rASCs第一代细胞I3BS洗两次，1500 r/min离心lOmin，2.5%戊二醛-0.2 mol/L 二甲砷酸固定，透射电镜观察细胞核以及细胞器特征。细胞表面有许多微绒毛，分布于胞体一侧，胞核不规则，细胞器丰富，胞浆内核糖体、线粒体、粗面型内质网、高尔基体、溶酶体较多，符合多能性细胞特征(图5)。为了鉴定我们分离培养得到的rASCs具有多向分化潜能，我们将rASCs向脂肪细胞和成骨细胞进行诱导。诱导方法如下:
I)成脂诱导:取rASCs第三代细胞，接种于放有玻片的六孔板。当细胞汇合率达95%时，换液为含10%FBS，I u M地塞米松，10 u g/mL胰岛素和0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的H-DMEM。四天后换液为H-DMEM(含10%FBS)，I y M地塞米松，10 y g/mL胰岛素，0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和200 ii M吲哚美辛。每隔3天换一次液，18天时，用油红O染色鉴定。2)成骨诱导:取rASCs第三代细胞，接种于放有玻片的六孔板。当细胞汇合率达95%时，换液为H-DMEM，含10%FBS，10 nM地塞米松，10 mM P甘油磷酸钠和150 yM L抗坏血酸-2-磷酸三钠盐。每隔3天换一次液，21天时，ALP和茜素红染色鉴定。结果表明，rASCs在上述诱导条件下能够向脂肪细胞和成骨细胞分化，具有多向分化潜能(图6)。三、本发明NSCs的培养及鉴定
取孕14天的SD大鼠,在无菌条件下取出子宫至于预冷的Hanks缓冲液中，分离出SD胎鼠，在解剖显微镜下找到腹侧中脑区，加入0.025%胰酶，37°C消化10 min,用DMEM/F12终止消化，吹匀，1500 r/min 离心 10 min,用 DMEM/F12 (含 20 ng/ml 的 bFGF 和 2%B27)重悬细胞，接种至T-25培养瓶，悬浮培养。每隔48h半量换液一次，每4天1:2传代一次，待细胞团增殖到一定数目时，换液为新鲜的Neural Basal培养基(含2% B27)。胎鼠中脑分离的神经干细胞生长状态良好，在原代培养第3d开始能观察到细胞分裂现象，杂质较多；培养第7天时能看到直径约为100 的克隆球，克隆球状态良好，球周围附着轮廓清晰的圆形的单个细胞，杂质逐渐减少；培养第IOd时多数克隆球直径达到200 iim;随着培养时间的逐渐延长，克隆球中心逐渐变黑，有的克隆球贴壁生长，球周围有细胞呈放射样生长。传代培养细胞增殖较原代培养快，在传代培养第7天时能形成直径约200iim的克隆球。 为了鉴定本发明分离得到的细胞是否为神经干细胞，我们将经过单克隆培养的神经干细胞克隆球连同培养基一通倒入50ml离心管，1000r/min离心5min,倒掉上清液后，用DMEM/F12培养基重悬其细胞沉淀。台盼蓝计数后，接种于已包被有多聚赖氨酸的放置于六孔培养板的玻片上，再未加血清的培养基培养3天后，神经球吸附在玻片上，对神经球进行nestin免疫荧光检测，检测结果为阳性(图7)。同时，在同一块六孔培养孔的不同培养孔中，将无血清培养基DMEM/F12 (含2%B27和20ng/ml的bFGF)换液为含10%FBS的DMEM/F12培养基，对神经干细胞进行体外诱导。诱导10天后，对诱导NSCs进行TH的免疫荧光鉴定，检测结果为阳性(图7)，证明分离得到的细胞团为神经干细胞，且能向神经元细胞分化。
权利要求
1.Lmxla介导的与神经干细胞共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法，包括以下步骤: 步骤(I):构建Lmxla基因克隆及重组质粒 以 Lmxla whole transcript cDNA (NM_138396)为模板，引物为:Pl up:5' -GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG-3',Pl down:5' -CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG-3', 通过PCR扩增获得带Sail和EcoR V酶切位点的DNA片段，将该片段插入pShuttle_CMV中，通过SalI和EcoR V双酶切鉴定，得到重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmxla，测序并与理论结果一致; 步骤(2):构建与包装重组腺病毒Ad-Lmxla 将步骤(I)重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmxla先后用PmeI线形化和CIAP进行5'去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组PAdEasy-1同时电转感受态细胞BJ-5183，得同源pAdEasy-1重组质粒,筛选阳性克隆,与pAdEasy-1成功进行同源重组的克隆能被PacI酶切出3.0kb或者4.5kb的片段； 筛选出的pAdEasy-1重组质粒经鉴定后转化XL_10 (Gold)，扩增、提取质粒,使质粒浓度达到0.1 ii g/ ii L，将质粒线性化后转染HEK-293细胞，使重组腺病毒质粒在HEK-293细胞中包装重组腺病毒Ad-Lmxla，10天后细胞病变脱落呈串珠状，漂浮于上清液中，收集腺病毒颗粒； 步骤(3):将感染Ad-Lmxla的rASCs与NSCs共培养分化为DA能神经元Ca)诱导前,取rASCs第二代细胞,接种于放有玻片且包被过多聚赖氨酸的六孔培养板，培养液为含10%FBS的L-DMEM ;培养的NSCs接种于transwell小室中，培养液为含2%B27 的 Neural Basal 培养液; (b)以最佳MOI的Ad-Lmxla感染rASCs，并将培养液更换为含2%B27的Neural Basal培养液，使细胞贴壁率维持在85%，三天后再换液为DMEM/F12诱导液I进行预诱导，部分细胞开始聚集； 以上DMEM/F12诱导液I由以下成分组成:2%FBS,.1.7 m SHH,20ng/mLbFGF, .6 mM 3 -巯基乙醇， DMEM/F12培养基； (c)将接种有NSCs的transwell小室放入接种有(b)的产物细胞的六孔板中，NSCs与(b)的产物细胞在含2% B27的Neural Basal培养液中共培养24h，细胞数目明显增多，3天后将诱导液换液为Neural Basal正式诱导液II，每隔3天换一次诱导液II，直至21天； 以上Neural Basal正式诱导液II由以下成分组成:2%B27,.1.7 m SHH,.100 ng/mLFGF-8,.20 ng/mLbFGF,1% N2 supplement，20m & -NADP, Neural Basal 培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(3)中rASCs第二代细胞的培养: Ca)氯胺酮麻醉恒河猴，无菌条件下取6kg成年恒河猴大网膜脂肪组织f 2g， PBS中洗涤去除残存的血迹，分离血管和纤维成分，0.1%1型胶原酶，37°C消化Ih ； (b)消化完成后，加入与I型胶原酶等体积的含10%新生小牛犊血清的L-DMEM培养液终止消化，过滤，1500 r/min离心3 min,弃上清,吸取底部沉淀用于rASCs培养； (c)以1\106接种于1'-25培养瓶中，371:，5%0)2条件下细胞培养中培养4天，至单层贴壁细胞贴壁率接近90%时，0.25%胰蛋白酶消化，1:2传代，之后随细胞扩增至90%时，按1:2持续体外传代培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(3)中NSCs的培养: 取孕14天的SD大鼠，在无菌条件下取出子宫置于预冷的Hanks缓冲液中，分离出SD胎鼠，在解剖显微镜下取腹侧中脑区，加入0.025%胰酶，37°C消化10 min,用DMEM/F12终止消化，吹匀，1500 r/min离心10 min，用含20 ng/mL bFGF和2%B27的DMEM/F12重悬细胞，接种至T-25培养瓶， 悬浮培养； 每隔48h半量换液一次，每4天1:2传代一次，待细胞团增殖换液为新鲜的含2% B27的Neural Basal培养基。
全文摘要
Lmx1a介导的与神经干细胞共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法，属于诱导干细胞替代缺损的神经元细胞治疗帕金森氏病的方法。本发明步骤有构建Lmx1a基因克隆及重组质粒，构建与包装重组腺病毒Ad-Lmx1a，将感染Ad-Lmx1a的rASCs与NSCs共培养分化为DA能神经元；以及rASCs和NSCs传代细胞的培养等。本发明诱导的神经元样细胞能分化出表达多巴胺能神经元细胞蛋白标志物，且诱导后的细胞可传导电信号或分泌神经递质，证明诱导细胞为神经元细胞。
文档编号C12N7/01GK103215226SQ201210543400
公开日2013年7月24日 申请日期2012年12月16日 优先权日2012年12月16日
发明者周艳, 李鸿钧, 孙茂盛, 严敏, 吴晋元 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所