专利名称：一种悬浮培养细胞的方法
技术领域：
本发明涉及医药生物领域，具体涉及ー种悬浮培养细胞的方法。体外细胞的培养方法包括贴壁培养和悬浮培养，贴壁培养(是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养；悬浮培养通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法；其中悬浮培养又可分为微载体悬浮培养及全悬浮培养。与贴壁培养相比，悬浮培养具有如下优点(1)可连续扩大生产量；(2)有利于细胞培养基中的营养物质和气体充分接触，而且易于控制培养条件(温度、pH、氧分压和CO2等)；(3)培养条件稳定，趋于均一，便于进行定量研究；(4)易于在连续密闭的系统中进行，減少了操作步骤和污染的机会；(5)可以长期连续培养，既可节省人力，又使细胞能持续维持在对数生长期；(6)悬浮培养的细胞仍保持原先对病毒的敏感性和生物学特性。基于上述优点，如何克服贴壁细胞培养时的缺点，充分利用悬浮培养的优点成为细胞培养中的重大难题。
发明内容
针对以上不足，本发明提供了一种贴壁细胞进行悬浮培养的方法，本方法将贴壁细胞利用细胞融合技术进行悬浮培养，充分利用了悬浮培养的优点，使得贴壁细胞可以进行简化、高效、大量的培养。本发明是通过以下技术方案实现的
一种悬浮培养细胞的方法，其包括如下步骤
(1)利用细胞融合技术将贴壁无限传代细胞系与有限传代悬浮细胞融合，建立既能无限传代又能悬浮培养的融合细胞系；
用方瓶贴壁培养从液氮中复苏的无限传代细胞系，培养条件为PH7. 0 7. 2，温度36 37°C，培养基为细胞培养液；培养时间48 72h，细胞单层长至90%，细胞密度为3 6X105cells/mL ；
将方瓶中单层长至90%的细胞用EDTA-胰酶消化分散，加入10mL血清浓度为15%细胞培养液，終止消化获得细胞悬液，并进行细胞计数；
取与上述传代细胞数目相等的动物源性淋巴细胞，混合后进行800rpm离心lOmin，获得混合细胞泥；
将上述混合细胞泥以10mL无血清细胞培养液重悬，在800rpm下离心10min，重复洗涤I次,除去残余血清；
弹动离心管底，将离心获得的细胞泥散开，向管中加入浓度为50%的PEG lmL，在Imin内匀速加完，并边加边轻轻晃动；加入9mL无血清细胞培养液，混合均匀，1000rpm离心5min,弃上清；缓慢加入10mL无血清细胞培养液,重悬细胞，1000rpm离心5min,弃上清；カロ入5mL血清含量为15%的细胞培养液，重悬细胞，转入5mL—次性细胞培养瓶中，置37°C温箱培养；同时设正常淋巴细胞对照；
(2)筛选悬浮生长的融合细胞；培养24h，用吸管轻轻吹打培养瓶底部3 5次，将培养液连同悬浮生长细胞转移至新的细胞培养容器，37°C培养；培养3 5天，培养过程中，每隔6 8h晃动ー下培养容器，以便于细胞的生长，连续培养7天以上，重复上述步骤数次，除去贴壁生长细胞，获得完全悬浮生长的细胞。将悬浮细胞在37°C连续培养7天以上，待残存的淋巴细胞或自身融合的淋巴细胞自然凋亡后，以获得无限传代细胞与淋巴细胞的融合细胞。(3)细胞稳定性的确定；
上述步骤(2)细胞培养过程中培养3 4天，补加血清含量为15%的细胞培养液I次；培养7天以上，获得完全悬浮生长的无限传代细胞与淋巴细胞的融合细胞，IOOOrpm离心5min，去上清，以新鲜培养液重悬，置于新的细胞培养容器中继续培养，传代I次；重复上述步骤，将细胞传10个代次以上，显微镜下观察。上述步骤(3)中细胞培养温度36 37°C、pH :7. 0 7. 4。本发明的有益效果是本发明利用细胞融合技术将贴壁培养的细胞驯化为可悬浮培养的细胞，充分利用了悬浮培养的优点，为利用悬浮细胞获得目的产物奠定基础，本方法所驯化悬浮细胞可利用含有血清的普通细胞培养液进行培养，与无血清培养液相比，大大降低了培养成本。本方法采用全悬浮培养，与微载体悬浮培养相比有以下优势无需昂贵的微载体，从而有效降低生产成本；可省去微载体培养中附加步骤如消化收获细胞等，从而简化生产过程，缩短生产时间，提高生产效率，并易于进行扩大培养。
图1为本发明显微镜下观察培养细胞的情況。图中A :培养10天，融`合细胞生长情况；B :培养10天，正常鸡胚脾细胞(淋巴细胞)生长情况；c :培养17天，融合细胞生长情况；D :培养17d，正常鸡胚脾细胞生长情況。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进ー步说明，以便本领域技术人员可以更好的了解本发明，但并不因此限制本发明。实施例1
(I)利用细胞融合技术，将DFl与鸡胚脾脏淋巴细胞进行融合，获得DFl与鸡胚淋巴细胞的融合悬浮细胞系。将18日龄SPF鸡胚无菌取脾脏，剪刀剪碎，加入ImL胰酶，37°C水浴消化lOmin，反复吹打数次，加入IOmL 15% MEM培养液，终止消化，4层纱布过滤。将滤液转移至15mL离心管，并进行细胞计数，细胞密度约为106/mL ；
将方瓶中单层长至90%的DFl细胞消化，加入IOmL 15% MEM终止消化，计数细胞数目；取等量的DFl与鸡脾淋巴细胞混合(共约2 X IO6个细胞)，800rpm离心lOmin，去上清，以无血清细胞培养液重悬，800rpm离心IOmin,再重复洗漆I次,除去残余血清；
轻轻弹动离心管，将上步获得的细胞泥松动，慢慢向管中加入浓度为50%的PEG ImL,且在Imin匀速加完，并边加边轻轻晃动；
慢慢加入9mL无血清细胞培养液,混勻，IOOOrpm离心5min,弃上清；缓慢加入IOmL无血清细胞培养液，重悬细胞，IOOOrpm离心5min，弃上清；加入5mL血清含量为15%的细胞培养液，重悬细胞，转入5mL —次性细胞培养瓶中，置37°C温箱培养。同吋，另取一部分脾脏悬液(约IO6个细胞)，置于15mL离心管，IOOOrpm离心5min，弃上清，加5mL血清含量为15%的细胞培养液，重悬细胞，转入5mL —次性细胞培养瓶中，置37°C温箱培养，作为对照。(2)筛选悬浮生长的融合细胞并确定细胞稳定性；
培养3d，补加2mL血清含量为15%的细胞培养液培养液；培养I周，轻轻晃动培养液，并收集培养液，IOOOrpm离心5min，去上清，加入新鲜培养液进行培养，次为传代I次；重复上述步骤，将细胞传10个代次以上，显微镜下观察，见图1 ;
通过上述步骤和观察，可以看到在培养17天后正常鸡胚脾脏淋巴细胞基本全部死亡，而DFl与鸡胚脾脏淋巴细胞的融合细胞生长正常，表明成功实现了 DFl与鸡胚脾脏淋巴细胞的融合，并获得了可稳定、悬浮培养的融合细胞系。在普通培养液中，淋巴细胞基本不发生分裂，且生命周期较短，而融合细胞 则能分裂生长，并表现出可无限传代的特性。
权利要求
1.一种悬浮培养细胞的方法，其包括如下步骤(1)利用细胞融合技术将贴壁无限传代细胞系与有限传代悬浮细胞融合，建立既能无限传代又能悬浮培养的融合细胞系用方瓶贴壁培养从液氮中复苏的无限传代细胞系，培养条件为PH7. O 7. 2，温度36 37°C，培养基为细胞培养液；培养时间48 72h，细胞单层长至90%，细胞密度为3 6X105cells/mL ；将方瓶中单层长至90%的细胞用EDTA-胰酶消化分散，加入IOmL血清浓度为15%细胞培养液，终止消化获得细胞悬液，并进行细胞计数；取与上述传代细胞数目相等的动物源性淋巴细胞，混合后在SOOrpm下离心lOmin，获得混合细胞泥；将上述混合细胞泥以IOmL无血清细胞培养液重悬，在SOOrpm下离心lOmin，重复洗涤I次,除去残余血清；弹动离心管底，将离心获得的细胞泥散开，向管中加入浓度为50%的PEG lmL，在Imin内匀速加完，并边加边轻轻晃动；加入9mL无血清细胞培养液，混合均匀，IOOOrpm离心5min,弃上清；缓慢加入IOmL无血清细胞培养液,重悬细胞，IOOOrpm离心5min,弃上清；加入5mL血清含量为15%的细胞培养液，重悬细胞，转入5mL于一次性细胞培养瓶中，置37°C温箱培养；同时设正常淋巴细胞对照；(2)筛选悬浮生长的融合细胞培养24h，用吸管轻轻吹打培养瓶底部3 5次，将培养液连同悬浮生长细胞转移至新的细胞培养容器，37°C培养；培养3 5天，培养过程中，每隔6 8h晃动一下培养容器，连续培养7天以上，重复上述步骤数次，除去贴壁生长细胞，获得完全悬浮生长的细胞；(3)细胞稳定性的确定上述步骤(2)细胞培养过程中培养3 4天，补加血清含量为15%的细胞培养液I次;培养7天，IOOOrpm下离心5min，去上清液，以新鲜培养液重悬，置于新的细胞培养容器中继续培养，传代I次；重复上述步骤，将细胞传10个代次以上，显微镜下观察。
2.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞的方法，其特征在于所述步骤(3)中细胞培养温度36 37°C、pH :7. O 7· 4。
全文摘要
本发明提供一种悬浮培养细胞的方法，其包括如下步骤(1)利用细胞融合技术将贴壁无限传代细胞系与有限传代悬浮细胞融合，建立既能无限传代又能悬浮培养的融合细胞系；(2)筛选悬浮生长的融合细胞；(3)将融合细胞系传代培养10个以上代次，确定该细胞系的稳定性。本发明的有益效果是本发明利用细胞融合技术将贴壁培养的细胞驯化为可悬浮培养的细胞，充分利用了悬浮培养的优点，为利用悬浮细胞获得目的产物奠定基础，本方法所驯化悬浮细胞可利用含有血清的普通细胞培养液进行培养，与无血清培养液相比，大大降低了培养成本。本方法采用全悬浮培养，简化生产过程，缩短生产时间，提高生产效率，并易于进行扩大培养。
文档编号C12N5/02GK103045530SQ20121054200
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者徐明明, 张静, 马景霞 申请人:山东滨州沃华生物工程有限公司