专利名称：一种运用间接免疫荧光检测技术进行病毒敏感细胞克隆中筛选的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体的讲是一种运用间接免疫荧光检测技术进行病毒敏感细胞克隆株筛选的方法。
背景技术：
传统上，对于敏感细胞株的筛选是通过测定病毒毒价的方式实现的。然而，对于非致病变性的病毒，毒价的测定只能利用动物或其他方法进行，例如猪瘟兔化弱毒效价的测定。此种方法，费时费力，操作复杂，周期长，成本高，筛选效率低下。发明内容
针对以上不足，本发明提供了一种简便、快捷的敏感细胞株的筛选方法，具体的说，通过间接免疫荧光(IFA)方法进行细胞系纯净性的鉴定和不同单克隆细胞株敏感性鉴定，代替传统的病毒毒价的测定方法，以达到快速、简便、有效筛选单克隆细胞株的目的。
本发明是通过以下技术方案实现的一种运用间接免疫荧光检测技术进行病毒敏感细胞克隆株筛选的方法，包括以下步骤(1)细胞系纯净性的鉴定细胞的复苏培养用方瓶培养从液氮中复苏的细胞，培养条件包括pH7. O 7. 3，温度 36 37°C，培养基为细胞培养液；培养时间48 96h，细胞单层长至90% 100%，细胞密度在 3 6X 105cells/mL ； 细胞传代培养将上述步骤中长满单层的细胞用EDTA-胰酶消化分散，获得细胞悬液， 按照1:3的比例分传至方瓶；细胞接毒将_80°C保存的病毒抗原液4 8°C水中融化，取适量病毒液加入上述传代细胞悬液中，并保证病毒终浓度在100TCID5(l/mL 1000TCID5(l/mL，混匀，置温箱培养72 96h ；细胞带毒传代、铺96孔细胞板将长满单层的带毒细胞用EDTA-胰酶消化分散，获得细胞悬液，并进行细胞计数，取适量细胞悬液，按照有限稀释法铺96孔板，以获得单克隆细胞，温箱培养，直至单克隆细胞形成细胞岛；细胞系纯净性的判定按照间接免疫荧光法，对上述孔板进行IFA染色，荧光显微镜下观察结果，通过IFA荧光和单克隆细胞岛细胞形态观察，判断细胞系纯净性；细胞形态不同，单克隆株细胞感染荧光不同即具有不同的单克隆株，表明细胞系不纯净；(2)细胞系中单克隆细胞株的获得复苏细胞复苏代次靠前的细胞，在3代内调整细胞至状态最佳；分散细胞待细胞长至90%时，用EDTA-胰酶消化分散，镜下观察细胞多数呈单个分散状态；终点稀释细胞取IOuL消化好的细胞入含ImL 10%血清的培养基的指形管内，分散均匀后，依次10倍倍比稀释，吸取10_4至10_5稀释度的细胞悬液150uL入96孔板，观察各梯度内的细胞个数，并以一个细胞的稀释度为基准稀释细胞，铺入96孔板中，150uL/孔；
观察记录3天后，观察板内单个克隆的细胞岛，作好标记；
维持细胞生长及时更换细胞培养液，维持细胞生长，必要时将细胞克隆消化分散，重新在原孔贴附生长；
扩大培养细胞待上述96孔板内标记的细胞孔长满后，扩大培养，冻存保种；
(3)单克隆细胞株对病毒敏感性的鉴定
单克隆细胞株的接毒待细胞长至单层，将不同的单克隆细胞株用EDTA-胰酶消化分 散，获得细胞悬液，按1:2比例分传，铺96孔板，每个细胞株铺3 6个孔，IOOuL/孔，将预冷、无血清细胞培养液稀释好的病毒同步接上述96孔板细胞悬液中，IOOuL/孔，病毒接种剂量为10 100TCID5Q/mL，同时设阴性对照和阳性对照，将细胞板置温箱培养36 60h ；单克隆细胞株的敏感性鉴定将上述单克隆细胞株的接毒步骤中的96孔板取出，按照间接免疫荧光法进行IFA染色，荧光显微镜下计数荧光斑数目，并利用SPSS软件对不同克隆细胞株及正常细胞系荧光斑数目进行统计学分析，判断细胞敏感性差异。上述间接免疫荧光法的具体步骤为
a、将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养板孔内液体，用O.lmol/L、PH7. 2的PBS洗涤3次，每次2 3min，并甩干；
b、加入_20°C预冷的甲醇100uL，4°C固定20 30min ；
C、弃去甲醇,室温自然挥干5min, PBS洗漆3次,每次2 3min,并甩干；
d、加入第一抗体,37°C吸附50min;
e、弃去第一抗体,用PBS漆3次,每次2 3min,并甩干； f>加入第二抗体，37 吸附40min ;
g、弃去第二抗体，PBS漆3次,每次2 3min；
h、置于荧光显微镜下观察荧光情况，观察荧光染色情况。上述PBS 的浓度为 O. lmol/L、PH 为 7. 2。上述步骤(3)中阴性对照为不接毒正常未纯化的细胞系。上述步骤(3)中阳性对照为接毒正常未纯化的细胞系。上述步骤(3)中将细胞板置温箱培养45h。上述第一抗体为PBS稀释的猪瘟阳性血清。上述第二抗体为PBS稀释的FITC标记兔抗猪IgG。本发明的有益效果是1.本方法检测时间短，只需3天即可对单细胞克隆对病毒敏感性进行鉴定。2.操作相对简单，方法易行，可用于非致病型病毒敏感细胞株的大量筛选。3.结果稳定，可重复性强，与测定毒价方法效果一致。
图1为对克隆A、B、C检测结果以及对照试验；
图2为对克隆D、E、F、G检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明，以便本领域技术人员可以更好的了解本发明，但并不因此限制本发明。
(I)细胞系纯净性的鉴定ST细胞的复苏培养用方瓶培养从液氮中复苏的ST细胞，培养条件包括pH7. 2，温度 370C，培养基为含有8%猪瘟专用血清的MEM ;培养时间72h，细胞单层长至100% ；ST细胞传代培养将长满单层的ST细胞用EDTA-胰酶消化分散，获得细胞悬液，按照 1:3的培养面积比例分传至方瓶；细胞接毒将-80°C保存的猪瘟兔化弱毒(中国兽医药品监察所保藏，保藏号AV1412) 细胞毒(毒价为103_°TCID5(i/0. 11^)4 81水中融，取500此病毒液，加入到上述方瓶传代细胞悬液(IOmL)中，病毒终浓度为500TCID5(l/mL，混匀，置温箱培养72h。
ST细胞带毒传代、铺96孔细胞板将长满单层的带毒ST细胞用EDTA-胰酶消化分散，获 得细胞悬液，并进行细胞计数，取适量细胞悬液，按照有限稀释法铺96孔板，以获得单克隆细胞，温箱培养，直至单克隆细胞形成细胞岛。
细胞系纯净性的判定按照间接免疫荧光法，对上述孔板进行IFA染色，分别在荧光显微镜和普通显微镜下观察结果，通过IFA荧光和单克隆细胞岛细胞形态观察，判断细胞系纯净性。细胞形态不同，单克隆株细胞感染荧光不同即表明细胞系不纯净。
ST细胞系纯净性鉴定结果将ST细胞接猪瘟兔化弱毒，并带毒传至96孔板，培养72h，进行IFA染色，结果发现， ST细胞不同单克隆细胞形成的单克隆岛荧光染色效果不同，呈现不同的荧光亮度，表明该 ST细胞系种存在对猪瘟病毒敏感性不同的克隆株。结果如图1所示，克隆A、B为猪瘟敏感型细胞株，而克隆C则不敏感。
表I ST单克隆细胞IFA染色荧光斑数目结果及比较 实验顺序细胞株名称荧光斑数目荧光斑平均数统计学比较(P)
权利要求
1.一种运用间接免疫荧光检测技术进行病毒敏感细胞克隆株筛选的方法，包括以下步骤(1)细胞系纯净性的鉴定细胞的复苏培养用方瓶培养从液氮中复苏的细胞，培养条件包括pH7. O 7. 3，温度 36 37°C，培养基为细胞培养液；培养时间48 96h，细胞单层长至90% 100%，细胞密度在 3 6X 105cells/mL ；细胞传代培养将上述步骤中长满单层的细胞用EDTA-胰酶消化分散，获得细胞悬液， 按照1:3的比例分传至方瓶；细胞接毒将_80°C保存的病毒抗原液4 8°C水中融化，取适量病毒液加入上述传代细胞悬液中，并保证病毒终浓度在100TCID5(l/mL 1000TCID5(l/mL，混匀，置温箱培养72 96h ；细胞带毒传代、铺96孔细胞板将长满单层的带毒细胞用EDTA-胰酶消化分散，获得细胞悬液，并进行细胞计数，取适量细胞悬液，按照有限稀释法铺96孔板，以获得单克隆细胞，温箱培养，直至单克隆细胞形成细胞岛；细胞系纯净性的判定按照间接免疫荧光法，对上述孔板进行IFA染色，荧光显微镜下观察结果，通过IFA荧光和单克隆细胞岛细胞形态观察，判断细胞系纯净性；(2)细胞系中单克隆细胞株的获得复苏细胞复苏代次靠前的细胞，在3代内调整细胞至状态最佳；分散细胞待细胞长至90%时，用EDTA-胰酶消化分散，镜下观察细胞多数呈单个分散状态；终点稀释细胞取IOuL消化好的细胞入含ImL 10%血清的培养基的指形管内，分散均匀后，依次10倍倍比稀释，吸取10_4至10_5稀释度的细胞悬液150uL入96孔板，观察各梯度内的细胞个数，并以一个细胞的稀释度为基准稀释细胞，铺入96孔板中，150uL/孔；观察记录3天后，观察板内单个细胞岛的克隆，作好标记；维持细胞生长及时更换细胞培养液，维持细胞生长，必要时将细胞克隆消化分散，重新在原孔贴附生长；扩大培养细胞待上述96孔板内标记的细胞孔长满后，扩大培养，冻存保种；(3)单克隆细胞株对病毒敏感性的鉴定单克隆细胞株的接毒待细胞长至单层，将不同的单克隆细胞株用EDTA-胰酶消化分散，获得细胞悬液，按1:2比例分传，铺96孔板，每个细胞株铺3 6个孔，IOOuL/孔，将预冷、无血清细胞培养液稀释好的病毒同步接上述96孔板细胞悬液中，IOOuL/孔，病毒接种剂量为10 100TCID5Q/mL，同时设阴性对照和阳性对照，将细胞板置温箱培养36 60h ； 单克隆细胞株的敏感性鉴定将上述单克隆细胞株的接毒步骤中的96孔板取出，按照间接免疫荧光法进行IFA染色，荧光显微镜下计数荧光斑数目，并利用SPSS软件对不同克隆细胞株及正常细胞系荧光斑数目进行统计学分析，判断细胞敏感性差异。
2.根据权利要求所述的一种运用间接免疫荧光检测技术进行病毒敏感细胞克隆株筛选的方法，其特征在于所述间接免疫荧光法的具体步骤为a、将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养板孔内液体，用O. lmol/L、PH7. 2的PBS洗涤3次，每次2 3min，并甩干；b、加入_20°C预冷的甲醇100 uL，4°C固定20 30min ； C、弃去甲醇,室温自然挥干5min, PBS洗漆3次,每次2 3min,并甩干； d、加入第一抗体,37°C吸附50min； e、弃去第一抗体,用PBS漆3次,每次2 3min,并甩干； f、加入第二抗体,37 吸附40min； g、弃去第二抗体，PBS漆3次,每次2 3min； h、置于荧光显微镜下观察荧光情况，观察荧光染色情况。
3.根据权利要求2所述的一种运用间接免疫荧光检测技术进行病毒敏感细胞克隆株筛选的方法，其特征在于所述PBS的浓度为O. lmol/L、PH为7. 2。
4.根据权利要求1所述的一种运用间接免疫荧光检测技术进行病毒敏感细胞克隆株筛选的方法，其特征在于所述步骤(3)中阴性对照为不接毒正常未纯化的细胞系。
5.根据权利要求1所述的一种运用间接免疫荧光检测技术进行病毒敏感细胞克隆株筛选的方法，其特征在于所述步骤(3)中阳性对照为接毒正常未纯化的细胞系。
6.根据权利要求1所述的一种运用间接免疫荧光检测技术进行病毒敏感细胞克隆株筛选的方法，其特征在于所述步骤(3)中将细胞板置温箱培养45h。
7.根据权利要求2所述的一种运用间接免疫荧光检测技术进行病毒敏感细胞克隆株筛选的方法，其特征在于所述第一抗体为PBS稀释的猪瘟阳性血清。
8.根据权利要求2所述的一种运用间接免疫荧光检测技术进行病毒敏感细胞克隆株筛选的方法，其特征在于所述第二抗体为PBS稀释的FITC标记兔抗猪IgG。
全文摘要
发明涉及生物技术领域，更具体的讲是一种运用间接免疫荧光检测技术进行病毒敏感细胞克隆株筛选的方法，包括以下步骤细胞系纯净性的鉴定；细胞系中单克隆细胞株的获得；单克隆细胞株对病毒敏感性的鉴定，本发明的有益效果是本方法检测时间短，只需3天即可对单细胞克隆对病毒敏感性进行鉴定；.操作相对简单，方法易行，可用于非致细胞病变型病毒敏感细胞株的大量筛选；结果稳定，可重复性强，与测定毒价方法效果一致。
文档编号C12N5/071GK102994445SQ20121054198
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者牛成明, 何洪波, 陈申秒 申请人:山东滨州沃华生物工程有限公司